dCas9-VPR mRNAおよび化学合成ガイドRNAのエレクトロポレーションによるCRISPRa遺伝子の活性化 

THP-1およびK-562細胞に、Lonza 2bシステムを使用して、dCas9-VPR mRNA（5 µg, Cat # CAS12024）、Puro dCas9-VPR mRNA（5 ug, Cat # CAS12026）、またはEGFP dCas9-VPR mRNA（5 µg, Cat # CAS12025）のいずれかと、化学合成tracrRNA（25 nM, Cat # U-002005-05）、およびTTNを標的とるするプールフォーマットのCRISPRa crRNA（5 uM, Cat # P-005395-01-0005）またはnon-targetingコントロール（NTC, 25 nM, Cat # U-009500-10-05）をエレクトロポレーションしました。トランスフェクションの48時間後に細胞を回収し、全RNAを単離しました。 相対的な遺伝子発現は、RT-qPCRを使用して測定しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。

FACSを使用して、EGFP dCas9-VPR mRNAを含む細胞を選択し、遺伝子転写活性化を強化することができる

U2OS細胞を透明な6ウェルプレートにウェルあたり200,000細胞で播種しました。24時間後、細胞にCRISPRa EGFP dCas9-VPR mRNA（2 µg, Cat # CAS12025）、化学合成tracrRNA（25 nM, Cat # U-002005-05）、およびIL1R2を標的とするプールフォーマットCRISPRa crRNA（25 nM, Cat # P-007960-01-0005）またはnon-targetingコントロール（NTC、25 nM, Cat # U-009500-10-05）を、DharmaFECT Duo（2 µg /ウェル, Cat # T-2010-01）を使用してコトランスフェクトしました。トランスフェクションの24時間後に、細胞をトリプシン処理し、FACSを実行し、細胞をNegative、Dim、Top 10％の3つのカテゴリーに分類しました。細胞を6ウェルディッシュに再播種し、回復させました。24時間後、全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。ソーティングされた細胞のNegative集団は、活性化を示していません。Dimとソーティングをしなかった集団は、約120倍の活性化を示し、Top 10％の集団は450倍の活性化を示しました。

ピューロマイシンは、Puro dCas9-VPR mRNAを含む細胞を選択し、遺伝子転写活性化を強化するために使用できる

U2OS細胞を透明な6ウェルプレートにウェルあたり200,000細胞で播種しました。24時間後、細胞にPuro dCas9-VPR mRNA（2 µg, Cat # CAS12026）、化学合成tracrRNA（25 nM, Cat # U-002005-05）、およびPOU5F1（25 nM, Cat # P-019591-01-0005）、IL1R2（25 nM, Cat # P-007960-01-0005）、TFAP2C（25 nM, Cat # P-005238-01-0005）、TTN（25 nM, カタログ番号：P -005395-01-0005）を標的とするCRISPRa化学合成crRNAまたはnon-targetingコントロール（NTC, 25 nM, Cat # U-009500-10-05）を、DharmaFECT Duoを使用してコトランスフェクトしました。トランスフェクションの24時間後に、2 µg/mlのピューロマイシン増殖培地を細胞に添加し、もう一方のプレートに通常の増殖培地を添加しました。トランスフェクションの48時間後にクリスタルバイオレットアッセイを実施し、画像キャプチャをし、生存率と全RNAを評価しました。相対的な遺伝子発現は、RT-qPCRを使用して測定しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。テストしたすべての遺伝子について、選択処理をしていないサンプルと比較した場合、活性化の3〜5倍の濃縮が観察されました。

Efficient gene activation with dCas9-VPR mRNA and target sgRNA

U2OS were plated at 10,000 cells/well and transfected using DharmaFECT Duo (0.15uL/well) Transfection Reagent with 25nM individual or pooled CRISPRa synthetic single guide RNA (sgRNA) targeting POU5F1, SOX2, EGFR, MYC1 or TTN and 200 ng / well of CRISPRmod CRISPRa dCas9-VPR mRNA. Cells were harvested at 72 hours post-transfection and gene expression was assessed using RT-qPCR. Relative fold transcriptional activation for each gene was calculated with the Cq method using beta-actin as the housekeeping gene and normalized to an experiment using non-targeting control sgRNA.