CRISPR activation

改変CRISPRシステムを用いた遺伝子発現のアップレギュレーション

 

CRISPR activation(CRISPRa)は、特異性の高い遺伝子過剰発現のための最適な方法です。CRISPRaは、不活化されたCRISPR-Cas9システム(dCas9)を用いて、ネイティブコンテキスト内でターゲット遺伝子をアップレギュレートします。この方法は、cDNAやORFなどの従来の遺伝子過剰発現技術に比べて多くの利点があります。

 

CRISPRaの利点

  • 一過的または持続的に遺伝子過剰発現が可能
  • CRISPRベースの遺伝子標的特異性
  • 遺伝子のネイティブコンテキスト内でのアップレギュレーション
  • ナチュラルな細胞内転写後処理
  • 生物学的に適切な過剰発現モデル 

Activate your gene of interest

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CRISPRaシステム

dCas9-VPR system with sgRNA and crRNA:tracrRNA

HorizonのCRISPRmod CRISPRaシステムには、2つのコンポーネント(アクティベータータンパク質(VPR)に融合した特殊なdCas9と、遺伝子の転写開始部位(TSS)のすぐ上流の領域をターゲットにするように特別に設計されたガイドRNA)が必要です。ガイドRNAはdCas9-VPRと複合体を形成し、アクティベーター複合体をDNAターゲットサイトに誘導します(図1)。

Horizonは、アクティベータータンパク質とガイドRNA導入の両方にレンチウイルスアプローチと一過性のアプローチを提供します。

dCas9-VPR

CRISPR-Cas9ベースのCRISPRaシステムでは、ネイティブのCas9は、RuvCIおよびHNHヌクレアーゼドメインの点突然変異によってDNA切断機能が消失しています。これらの変異は、Cas9タンパク質をdCas9(deactivated Cas9または dead Cas9)に変化させます。このdCas9タンパク質は、さまざまな転写活性化因子を融合することによってさらに改変されています。

HorizonのCRISPRaシステムは、汎用されているdCas9-VPRアクティベーションシステムに基づいています。SAMなどの他の転写活性化戦略は、こちらで説明されています。dCas9-VPRシステムは、dCas9がC末端で3つの転写活性化因子(VP64、p65、およびRta)(参考文献1〜7)に融合していることにより機能します。

CRISPRaガイドRNA

CRISPRaガイドRNAは、標的遺伝子のプロモーター領域または転写開始部位(TSS)の上流にある配列を標的にして転写活性化をもたらします(参考文献3,5)。機能的なガイドRNAの設計は困難な場合があります。なぜなら、TSSは常に十分な注釈が付けられているとは限らず、また、他のタンパク質因子のためにアクセスできないこともあるためです。HorizonのCRISPRaガイドRNAのデザインは、機械ラーニング技術を介して開発された公開済みのCRISPRa v2アルゴリズムを使用しています(8)。アルゴリズムは、FANTOMおよびEnsemblデータベースを使用してTSSを予測し、クロマチン、位置、および配列データを組み込んで、非常に効果的なガイドRNA設計を予測しました。遺伝子に代替TSS(遺伝子の6.8%)がある場合、少数の遺伝子(0.1%)に3つ以上のTSSがある場合は追加の課題が発生します。Horizonは、TSSごとに10個のガイドRNAデザインを、予測される機能の順にランク付けしてリストしています。

HorizonのCRISPRaガイドRNAは、化学合成crRNAまたは発現sgRNAフォーマットのいずれかとしてご提供しています。


 

混合物(プール)によるCRISPRa効率の向上

複数のCRISPRaガイドRNAデザインの混合物(プール)を作成すると、遺伝子転写活性化の増加(Figure 2a)、または最も機能的な個別のindividualフォーマットのcrRNAと同等の遺伝子転写活性化(Figure 2b)のいずれかが生じることがわかっています。

公開済みのアルゴリズムで設計されたガイドRNA間のオーバーラップを調べたところ、多くの遺伝子(> 70%)で、ガイドRNAのターゲットサイトのオーバーラップが、ほとんどまたは全くないことがわかりました。これらの遺伝子の場合、通常、gRNAをプールすると転写活性化レベルが上昇します。TSSでは、遺伝子の一部のサブセット(〜12%)のみが4つのデザインすべてと重複しています。これらの遺伝子について、プールフォーマットであれば、一般的に、最も効果的なgRNAと同様に機能することがわかりました。概して、プールフォーマットは最大の遺伝子転写活性化を促進するための優れた戦略と言えます。プールフォーマットは、たとえば、プレートを用いて複数の遺伝子の分析を実行する場合など、実験の規模を縮小するのにも役立ちます。

Pooling the crRNAs can further enhance the transcriptional activation
プールフォーマットのcrRNAでは遺伝子転写活性化が促進される
Figure 2. dCas9-VPRを安定して発現するU2OS細胞を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、EGFR(A)またはPOU5F1(B)を標的とする化学合成crRNA:tracrRNA(25 nM)をDharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトしました。デザイン済みcrRNAは、個別のindividualフォーマット、またはプールフォーマット(合計濃度25 nMまで)で使用しました。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を計算しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用してΔΔCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。


 

遺伝子転写活性化の確認

RT-qPCR、ウエスタンブロット、または免疫蛍光分析など、遺伝子の転写活性化を確認する方法はたくさんあります。通常、non-targetingコントロールとCRISPRaガイドRNAで処理されたサンプル間のターゲット遺伝子発現レベルの相対的変化を測定する最も速くて簡単な方法はRT-qPCRです。RT-qPCR分析は、SYBRグリーン法またはプローブベースの遺伝子発現アッセイのいずれかで機能します。遺伝子転写活性化のためにRT-qPCRを実行する際に注意すべきことの1つは、CRISPRaの前に遺伝子発現レベルが検出されない可能性があることです。この場合、ΔΔCq分析法を使用する場合、計算を実行するにはゼロ以外の値が必要であるため、qPCR機器の検出限界を表す任意の値が「検出不能」のプレースホルダーとして使用されます。ほとんどの場合、この値は、プログラムされたサイクル数と機器のCq決定方法に応じて、35〜40になります。多くのプロトコルでは、標準のqPCRサイクリング条件に追加のサイクル(合計で最大45)を追加することを推奨しています。CRISPRa実験を設計する際の重要な考慮事項は、遺伝子転写活性化のレベルがそれぞれの細胞タイプの基本的なターゲット発現レベルと相関することです。基礎発現の低い遺伝子ではより高い活性化(100〜10,000倍)が観察される可能性がありますが、中程度から高度に発現する遺伝子では活性化の倍数が低くなります(通常は100倍未満)。CRISPRaを実行する前に、目的の細胞株の基礎発現レベルを決定して、達成できる転写活性化に対する期待値を設定することは価値があります。例えば、遺伝子POU5F1は、iPSCのような多能性細胞で高度に発現する転写因子(OCT4)をコードしますが、細胞が分化すると通常は低発現します。POU5F1は、ポジティブコントロールとして推奨される遺伝子の1つですが、幹細胞を扱う場合、これは論理的な選択ではありません。ここでは、iPSC(Figure 3A)およびU2OS-dCas9-VPR導入細胞集団(骨肉腫細胞株)(Figure 3B)におけるPOU5F1の相対的な遺伝子転写活性化を示します。予想通り、iPS細胞ではPOU5F1の転写活性化は低い(〜1.2倍)が、骨肉腫細胞では高い転写活性化(〜600倍)が見られます。 

Transcriptional activation depends on endogenous gene expression levels
転写活性化は内在性遺伝子発現レベルに依存する
Figure 3. A. 96ウェルシャトル溶液P3を使用したメーカーのプロトコールに従って、ヒトiPSC(Thermo Scientific Cat#A18945)にdCas9-VPRおよびsgRNA発現ベクターをヌクレオフェクトしました。B. dCas9-VPRを安定して発現するU2OS細胞を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬(96ウェルプレートで0.15 µL/ウェル)を使用してPOU5F1(25 µM)をターゲットとする化学合成crRNA:tracrRNAポジティブコントロール #1でトランスフェクトしました。両方の実験(AおよびB)で、トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRの準備をしました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するΔΔCq法で計算し、non-targetinコントロールに対して正規化しました。

 


 

CRISPRa実験のための考慮事項

CRISPRaの実験条件には多くのオプションと考慮事項があります。一般に、ユーザーは、dCas9-VPR安定発現細胞集団で作業するときに、最も強力な遺伝子転写活性化を得ることができます。長時間のアッセイ後に測定する場合(96時間以上)では、多くの研究者がレンチウイルスsgRNAを選択します。短時間のアッセイ(96時間未満)の場合、化学合成crRNA:tracrRNAまたはプラスミドsgRNAは同等の遺伝子転写活性化をもたらします。

dCas9-VPRソース ガイドRNAフォーマット デリバリー方法 メリット
dCas9-VPR安定発現細胞、または
dCas9-VPR安定発現細胞にLentiviral dCas9-VPR particleを形質導入し選択
CRISPRa化学合成 crRNA:tracrRNA 形質導入またはエレクトロポレーション
  • 短時間のアッセイ
  • 標的遺伝子の転写活性化を高めるためのプールフォーマット crRNAを選択可能
  • マルチプレックスで、1つ以上の遺伝子の転写活性化が可能
  • アレイ化スクリーニングが可能
CRISPRa Lentiviral sgRNA particle 形質導入
  • 比較的長時間のアッセイのための安定した発現
  • 低MOI:ゲノム当たり1コピーの導入により、安定的に転写活性化を実現
CRISPRa Lentiviral sgRNA plasmid 形質導入またはエレクトロポレーション
  • ピューロマイシン選択による短時間アッセイ
  • マルチプレックスで、1つ以上の遺伝子の転写活性化が可能
Lentiviral dCas9-VPR plasmid CRISPRa Lentiviral sgRNA plasmid

コトランスフェクションまたはエレクトロポレーション

  • 抗生物質を用いた選択による短時間のアッセイ

  • レンチウイルスフリー

dcas9-VPR mRNA CRISPRa 化学合成 crRNA:tracrRNA コトランスフェクションまたはエレクトロポレーション
  • 外来DNAの導入がありません。
  • EGFPおよびピューロマイシン耐性遺伝子をマーカーとした遺伝子転写活性化細胞の濃縮
Table 1. CRISPRa実験のオプションと推奨事項

 

HorizonのCRISPRa製品プラットフォーム

Horizonは、遺伝子転写活性化実験にCRISPRaを使用するための複数の製品をご用意しています。

CRISPRa dCas9-VPR:
  1. dCas9-VPR安定発現細胞株から始めることができます。
  2. 安定発現細胞株を作製するための、プロモーターを選択できる発現ベクターは、精製プラスミドまたはレンチウイルス粒子をご用意しています。
  3. DNA-freeの実験の場合は、dCas9-VPR mRNAを使用します(濃縮のためのEGFPまたはピューロマイシンマーカーを選択できます)。
CRISPRaガイドRNA:

すべてのヒトおよびマウス遺伝子に対するCRISPRa用デザイン済み化学合成crRNAsまたは lentiviral sgRNAを提供しています。

CRISPRa化学合成crRNAは、個別のindividual、set-of-4、またはプール(上位4つのデザインの等モル混合物)フォーマットのcrRNA試薬が用意されています。これらは、Cherry-pickカスタムライブラリー デザインツールを使用してチューブまたはマルチウェルプレートでお届けすることもできます。このガイドフォーマットは、化学合成tracrRNAとともに使用する必要があります。

CRISPRaレンチウイルスsgRNAは、精製レンチウイルス粒子またはグリセロールストックのいずれかで、個別のcrRNA試薬またはset-of-4フォーマットが用意されています。

デザイン済みCRISPRaガイドRNA製品は、Horlbeck et al.の v2アルゴリズムによるスコアリングガイドRNAデザインの上位4つを表しています。該当する場合、他のTSS用の追加の4つのガイドRNAは、それぞれP1およびP2としてラベル付けされます。遺伝子のCRISPRaガイドRNAオプションにP1とP2の両方の指定がある場合は、実験のために両方をテストすることが有益な場合があります。遺伝子のCRISPRaガイドRNAにP1またはP2ラベルがない場合、単一の開始部位のみが定義されます。2つ以上のTSSが同定された少数の遺伝子については、カタログアイテムとしてP1とP2のみを提供しますが、カスタムリクエストとして公開されたアルゴリズム(8)の設計に基づいて任意のガイドRNAを製造できます。

 

Featured products

CRISPRaガイドcrRNA
化学合成およびレンチウイルス発現のCRISPRa crRNAは、あらゆるヒトまたはマウス遺伝子の非常に特異的な転写活性化を実現します。

View CRISPRa guide RNA

'CRISPRa-ready'のdCas9-VPR安定発現細胞株

汎用されるさまざまな細胞タイプをご用意しています。遺伝子転写活性化実験用のCRISPRaガイドRNAを導入する準備ができている細胞株です。

View CRISPRa ready cells

dCas9-VPR試薬
精製されたdCas9-VPR mRNAまたはレンチウイルス粒子は、あらゆるCRISPRaワークフローにソリューションを提供します。

View CRISPRa dCas9

CRISPRaコントロール
CRISPRa実験条件の評価のためのポジティブおよびnon-targetingコントロール

View CRISPRa controls


 

References

  1. L. A. Gilbert et al., CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154, 442–451 (2013).
  2. W. Cheng et al., Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 23, 1163–1171 (2013).
  3. L. A. Gilbert et al., Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159, 647–661 (2014).
  4. M. E. Tanenbaum, L. A. Gilbert, L. S. Qi, J. S. Weissman, R. D. Vale, A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159, 635–646 (2014).
  5. S. Konermann et al., Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517, 583–588 (2015).
  6. Chavez et al., Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nat. Methods. 12, 326–328 (2015).
  7. J. G. Zalatan et al., Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell. 160, 339–350 (2015).
  8. M. A. Horlbeck et al., Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. eLife. 5, e19760 (2016).
  9. Chavez et al., Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nat Methods. 7, 563–567 (2016)