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CRISPR activation

改変CRISPRシステムを用いた遺伝子発現のアップレギュレーション

 

CRISPR activation(CRISPRa)は、特異性の高い遺伝子過剰発現のための最適な方法です。CRISPRaは、不活化されたCRISPR-Cas9システム(dCas9)を用いて、ネイティブコンテキスト内でターゲット遺伝子をアップレギュレートします。この方法は、cDNAやORFなどの従来の遺伝子過剰発現技術に比べて多くの利点があります。
  • 一時的または持続的に遺伝子過剰発現が可能
  • CRISPRベースの遺伝子標的特異性
  • 遺伝子のネイティブコンテキスト内でのアップレギュレーション
  • ナチュラルな細胞内転写後処理
  • 生物学的に適切な過剰発現モデル 

Activate your gene of interest

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CRISPRaシステム

dCas9-VPR system with sgRNA and crRNA:tracrRNA

CRISPR-Cas9ノックアウトシステムと同様に、CRISPRaにはCas9ヌクレアーゼとCRISPRa用に設計されたガイドRNAが必要です。

dCas9

CRISPR-Cas9ベースのCRISPRaシステムでは、ネイティブのCas9は、RuvCIおよびHNHヌクレアーゼドメインの点突然変異によってDNA切断機能が消失しています。これらの変異は、Cas9タンパク質をdCas9(deactivated Cas9または dead Cas9)に変化させます。このdCas9タンパク質は、さまざまな転写活性化因子を融合することによってさらに改変されています。

HorizonのCRISPRaシステムは、汎用されているdCas9-VPRアクティベーションシステムに基づいています。SAMなどの他の転写活性化戦略は、コチラ(リンクを付ける)で説明されています。dCas9-VPRシステムは、dCas9がC末端で3つの転写活性化因子(VP64、p65、およびRta)(参考文献1〜7)に融合していることにより機能します。

CRISPRaガイドRNA

CRISPRaガイドRNAは、標的遺伝子のプロモーター領域または転写開始部位(TSS)の上流にある配列を標的にして転写活性化をもたらします(参考文献3,5)。機能的なgRNAの設計は困難な場合があります。なぜなら、TSSは常に十分な注釈が付けられているとは限らず、また、他のタンパク質因子のためにアクセスできないこともあるためです。HorizonのCRISPRaガイドRNAのデザインは、機械ラーニング技術を介して開発された公開済みのCRISPRa v2アルゴリズムを使用しています(8)。アルゴリズムは、FANTOMおよびEnsemblデータベースを使用してTSSを予測し、クロマチン、位置、および配列データを組み込んで、非常に効果的なガイドRNA設計を予測しました。遺伝子に代替TSS(遺伝子の6.8%)がある場合、少数の遺伝子(0.1%)に3つ以上のTSSがある場合は追加の課題が発生します。Horizonは、TSSごとに10個のgRNAデザインを、予測される機能の順にランク付けしてリストしています。

HorizonのCRISPRaガイドRNAは、化学合成crRNAまたは発現sgRNAフォーマットのいずれかとしてご提供しています。


 

混合物(プール)によるCRISPRa効率の向上

複数のCRISPRaガイドRNAデザイン混合物(プール)を作成すると、遺伝子活性化の増加(Figure 2a)または最も機能的な個々のcrRNAと同等の遺伝子活性化(Figure 2b)のいずれかが生じることがわかっています。

公開済みのアルゴリズムで設計されたガイドRNA間のオーバーラップを調べたところ、多くの遺伝子(> 70%)で、ガイドRNAのターゲットサイトのオーバーラップが、ほとんどまたは全くないことがわかりました。これらの遺伝子の場合、通常、gRNAをプールすると転写活性化レベルが上昇します。TSSでは、遺伝子の一部のサブセット(〜12%)のみが4つのデザインすべてと重複しています。これらの遺伝子について、プールフォーマットであれば、一般的に、最も効果的なgRNAと同様に機能することがわかりました。概して、プールフォーマットは最大の遺伝子転写活性化を促進するための優れた戦略と言えます。プールフォーマットは、たとえば、プレートを用いて複数の遺伝子の分析を実行する場合など、実験の規模を縮小するのにも役立ちます。

プールフォーマットのcrRNAでは遺伝子転写活性化が促進される

Pooling the crRNAs can further enhance the transcriptional activation

Figure 2. dCas9-VPRを安定して発現するU2OS細胞を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、EGFR(A)またはPOU5F1(B)を標的とする化学合成crRNA:tracrRNA(25 nM)をDharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトしました。デザイン済みcrRNAは、個別のindividualフォーマット、またはプールフォーマット(合計濃度25 nMまで)で使用しました。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を計算しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用してΔΔCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。

 


 

遺伝子転写活性化の確認

RT-qPCR、ウエスタンブロット、または免疫蛍光分析など、遺伝子の転写活性化を確認する方法はたくさんあります。通常、non-targetingコントロールとCRISPRaガイドRNAで処理されたサンプル間のターゲット遺伝子発現レベルの相対的変化を測定する最も速くて簡単な方法はRT-qPCRです。RT-qPCR分析は、SYBRグリーン法またはプローブベースの遺伝子発現アッセイのいずれかで機能します。遺伝子転写活性化のためにRT-qPCRを実行する際に注意すべきことの1つは、CRISPRaの前に遺伝子発現レベルが検出されない可能性があることです。この場合、ΔΔCq分析法を使用する場合、計算を実行するにはゼロ以外の値が必要であるため、qPCR機器の検出限界を表す任意の値が「検出不能」のプレースホルダーとして使用されます。ほとんどの場合、この値は、プログラムされたサイクル数と機器のCq決定方法に応じて、35〜40になります。多くのプロトコルでは、標準のqPCRサイクリング条件に追加のサイクル(合計で最大45)を追加することを推奨しています。CRISPRa実験を設計する際の重要な考慮事項は、遺伝子転写活性化のレベルがそれぞれの細胞タイプの基本的なターゲット発現レベルと相関することです。基礎発現の低い遺伝子ではより高い活性化(100〜10,000倍)が観察される可能性がありますが、中程度から高度に発現する遺伝子では活性化の倍数が低くなります(通常は100倍未満)。CRISPRaを実行する前に、目的の細胞株の基礎発現レベルを決定して、達成できる転写活性化に対する期待値を設定することは価値があります。例えば、遺伝子POU5F1は、iPSCのような多能性細胞で高度に発現する転写因子(OCT4)をコードしますが、細胞が分化すると通常は低発現します。POU5F1は、ポジティブコントロールとして推奨される遺伝子の1つですが、幹細胞を扱う場合、これは論理的な選択ではありません。ここでは、iPSC(Figure 3A)およびU2OS-dCas9-VPR導入細胞集団(骨肉腫細胞株)(Figure 3B)におけるPOU5F1の相対的な遺伝子転写活性化を示します。予想通り、iPS細胞ではPOU5F1の転写活性化は低い(〜1.2倍)が、骨肉腫細胞では高い転写活性化(〜600倍)が見られます。

転写活性化は内在性遺伝子発現レベルに依存する

Transcriptional activation depends on endogenous gene expression levels

Figure 3. A. 96ウェルシャトル溶液P3を使用したメーカーのプロトコールに従って、ヒトiPSC(Thermo Scientific Cat#A18945)にdCas9-VPRおよびsgRNA発現ベクターをヌクレオフェクトしました。B. dCas9-VPRを安定して発現するU2OS細胞を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬(96ウェルプレートで0.15 µL/ウェル)を使用してPOU5F1(25 µM)をターゲットとする化学合成crRNA:tracrRNAポジティブコントロール #1でトランスフェクトしました。両方の実験(AおよびB)で、トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRの準備をしました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するΔΔCq法で計算し、non-targetinコントロールに対して正規化しました。

 


 

CRISPRa実験のための考慮事項

CRISPRaの実験条件には多くのオプションと考慮事項があります。一般に、ユーザーは、dCas9-VPR安定発現細胞集団で作業するときに、最も強力な遺伝子転写活性化を得ることができます。長時間のアッセイ後に測定する場合(96時間以上)では、多くの人がレンチウイルスsgRNAを選択します。短期間のアッセイ(96時間未満)の場合、化学合成crRNA:tracrRNAまたはプラスミドsgRNAは同等の遺伝子転写活性化をもたらします。

dCas9-VPRソース ガイドRNAフォーマット デリバリー方法 メリット
dCas9-VPR安定発現細胞、または
dCas9-VPR安定発現細胞にLentiviral dCas9-VPR particlesを形質導入し選択
化学合成 crRNA:tracrRNA 形質導入またはエレクトロポレーション
  • 短時間のアッセイ
  • 標的遺伝子の転写活性化を高めるためのプールフォーマット crRNAを選択可能
  • マルチプレックスで、1つ以上の遺伝子の転写活性化が可能
  • アレイ化スクリーニングが可能
Lentiviral sgRNA particles 形質導入
  • 比較的長時間のアッセイのための安定した発現
  • 低MOI:ゲノム当たり1コピーの導入により、安定的に転写活性化を実現
Lentiviral sgRNA plasmid 形質導入またはエレクトロポレーション
  • ピューロマイシン選択による短時間アッセイ
  • マルチプレックスで、1つ以上の遺伝子の転写活性化が可能
Lentiviral dCas9-VPR plasmid Lentiviral sgRNA plasmid

コトランスフェクションまたはエレクトロポレーション

  • ピューロマイシン選択による短時間アッセイ
  • マルチプレックスで、1つ以上の遺伝子の転写活性化が可能
dcas9-VPR mRNA 化学合成 crRNA:tracrRNA コトランスフェクションまたはエレクトロポレーション
  • ピューロマイシン選択による短時間アッセイ
  • マルチプレックスで、1つ以上の遺伝子の転写活性化が可能
Table 1. CRISPRa実験のオプションと推奨事項

 

HorizonのCRISPRa製品プラットフォーム

Horizonは、遺伝子転写活性化実験にCRISPRaを使用するための複数の製品をご用意しています。

dCas9-VPR:
  1. dCas9-VPR安定発現細胞株から始めることができます。
  2. 定発現細胞株を作製するための、プロモーターを選択できる発現ベクターは、精製プラスミドまたはレンチウイルス粒子をご用意しています。
  3. 3. DNA-freeの実験の場合は、dCas9-VPR mRNAを使用します(濃縮のためのEGFPまたはピューロマイシンマーカーを選択できます)。
CRISPRaガイドRNA:

CRISPRaでは、すべてのヒトおよびマウス遺伝子に対するデザイン済み化学合成crRNAsまたは lentiviral sgRNAを提供しています。

CRISPRa化学合成crRNAは、は個別のcrRNA試薬、set-of-4、またはプール(上位4つのデザインの等モル混合物)が含まれが含まれます。これらは、Cherry-pickカスタムライブラリー デザインツールを使用してチューブまたはマルチウェルプレートでお届けすることもできます。

CRISPRaレンチウイルスsgRNAは、精製レンチウイルス粒子またはグリセロールストックのいずれかで、個別のcrRNA試薬またはset-of-4として提供されます。

デザイン済みCRISPRaガイドRNA製品は、Horlbeck et al.の v2アルゴリズムによるスコアリングガイドRNAデザインの上位4つを表しています。該当する場合、他のTSS用の追加の4つのガイドRNAは、それぞれP1およびP2としてラベル付けされます。遺伝子のCRISPRaガイドRNAオプションにP1とP2の両方の指定がある場合は、実験のために両方をテストすることが有益な場合があります。遺伝子のCRISPRaガイドRNAにP1またはP2ラベルがない場合、単一の開始部位のみが定義されます。2つ以上のTSSが同定された少数の遺伝子については、カタログアイテムとしてP1とP2のみを提供しますが、カスタムリクエストとして公開されたアルゴリズム(8)の設計に基づいて任意のガイドRNAを製造できます。


Featured products

CRISPRaデザイン済みcrRNA
ヒトおよびマウスゲノムをカバーするこれらの化学合成RNAは、ヌクレアーゼ耐性があり、プールフォーマットまたは個別のcrRNA試薬として利用できます。

View crRNA

CRISPRaデザイン済みlentiviral sgRNA
ベクターベースのシングルガイドRNAのレンチウイルス粒子またはグリセロールストックは、ヒトおよびマウスの遺伝子をゲノム全体でカバーするようにデザイン済みを利用できます。

View sgRNA

dCas9-VPR安定発現細胞株
一般的な細胞株のバックグラウンドをご用意しており、直接遺伝子活性化のためにCRISPRaガイドRNAを導入して、直接に遺伝子転写活性化を行います。

View CRISPRa ready cells

dCas9-VPR mRNA
精製されたdCas9-VPRmRNAは、化学合成CRISPRa crRNAでコトランスフェクトまたはエレクトロポレーションした場合、DNA-freeのワークフローを提供します。

View dCas9 mRNA

Lentiviral dCas9-VPR
精製されたレンチウイルス粒子またはプラスミドDNAにより、幅広い細胞型で安定したdCas9-VPRヌクレアーゼ発現細胞集団を作製できます。

View lentiviral dCas9


 

References

  1. L. A. Gilbert et al., CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154, 442–451 (2013).
  2. W. Cheng et al., Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 23, 1163–1171 (2013).
  3. L. A. Gilbert et al., Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159, 647–661 (2014).
  4. M. E. Tanenbaum, L. A. Gilbert, L. S. Qi, J. S. Weissman, R. D. Vale, A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159, 635–646 (2014).
  5. S. Konermann et al., Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517, 583–588 (2015).
  6. Chavez et al., Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nat. Methods. 12, 326–328 (2015).
  7. J. G. Zalatan et al., Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell. 160, 339–350 (2015).
  8. M. A. Horlbeck et al., Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. eLife. 5, e19760 (2016).
  9. Chavez et al., Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nat Methods. 7, 563–567 (2016)