CRISPRシステムに厳密な時間軸制御を

機能性遺伝子発現の調節が二重に強化された、誘導型CRISPRシステム

Cas9を用いたCRISPRノックアウトは、標的DNAに二本鎖切断を導入することで遺伝子機能を破壊する強力な手法です。さらにCRISPR-Cas9は、野生型Cas9または不活性化Cas9（dCas9）融合体を用いることで、遺伝子工学や転写調節に広く応用されており、CRISPR転写抑制（CRISPRi）やCRISPR転写活性化（CRISPRa）への応用も可能となっています。しかし、これらの多くのシステムでは、 CRISPRによるノックアウトや転写制御を「いつ起こすか」を厳密に制御することは困難でした。Strict-Rは、CRISPRa、CRISPRi、そしてCRISPRノックアウトを強力かつ厳密に制御可能な、新しい低分子誘導型システムです。

Strict-R inducible CRISPRシステムの開発

精密でリークのない遺伝子調節を実現する二重制御機構

CRISPRノックアウト（CRISPRko）は、標的DNAの切断を介して遺伝子機能を精密かつ恒久的に破壊する手法です。一方、CRISPR modulationは、触媒活性を欠くdCas9を用い、DNA配列を改変することなく遺伝子発現を調節します。転写活性化因子または転写抑制因子と融合したdCas9を用いることで、標的遺伝子の発現を選択的に増減でき、研究者は機能ゲノミクス、シグナル伝達経路解析、治療薬研究などに応用できます。

テトラサイクリン（Tet）調節系は発現誘導を可能にする一方、OFF状態におけるリーク発現が生じやすく、結果の解釈を難しくする場合があります。この課題を克服するため、Strict-RではTet 転写制御に加え、FKBP12由来の不安定化ドメイン（DD）による翻訳後制御を組み合わせた、二重調節機構を設計しました。

Strict-R inducible CRISPRシステムでは、ドキシサイクリンおよびShield1リガンドが存在しない状態では、遺伝子の転写は抑制され、トタンパク質産生は不安定となります。両方の低分子が存在した場合のみ、Cas9またはdCas9融合タンパク質の強力かつ即時に、タイミングを制御した発現が誘導されます。この二重制御により、完全なCRISPR活性を維持しつつバックグラウンド活性を大幅に低減し、ON／OFF状態を厳密に制御できます。

対応システム：

• Strict-R inducible CRISPRaレンチウイルスシステム：dCas9-VPRを用いた誘導型CRISPR転写活性化
• Strict-R inducible CRISPRiレンチウイルスシステム：dCas9-SALL1-SDS3を用いた誘導型CRISPR転写抑制
• Strict-R inducible Cas9レンチウイルスシステム：Cas9ヌクレアーゼを用いた誘導型CRISPRノックアウト

Strict‑Rプラットフォームは、複数の細胞株および標的において、最小限のリークで、強力かつ調整可能な遺伝子制御を実現し、高度な機能ゲノミクス研究に向けて精密な時間的制御を提供します。

Dharmacon™ Strict-R™ inducible CRISPRレンチウイルスシステムによるCas9 エフェクターの転写レベルおよび翻訳後レベルでの制御

転写制御および翻訳後制御の両方を用いて発現を調節する、StrictR™ inducible CRISPRレンチウイルスシステムの概念図。ドキシサイクリンおよびShield1が存在しない場合、システムは「OFF」状態です。TRE3Gプロモーターのリークによりわずかに翻訳されたCas9またはdCas9エフェクターには、FKBP12由来の不安定化ドメイン（デグロン）が分解タグとして付与されているため、迅速にプロテアソーム分解へ誘導されます。ドキシサイクリンの添加によりTRE3Gプロモーターからの強力な転写が誘導され、さらにShield1の添加によってCas9またはdCas9エフェクターが安定化すると、使用するStrict-R CRISPR技術に応じて、遺伝子の活性化、抑制、またはノックアウトが誘導されます。

Dharmacon™ Strict-R™ inducible CRISPRレンチウイルスシステムワークフロー

StrictR inducible CRISPRシステムのワークフロー概要を示します。まず、StrictR CRISPRレンチウイルスコンストラクトを細胞に導入し、その後、ガイドRNAを導入します。ドキシサイクリンおよびShield1による誘導により、標的遺伝子の活性化、抑制、またはノックアウトが可能となり、続く表現型解析を行うことができます。表1には、Strict-R CRISPRシステムの各バリアントに対応する選択マーカーがまとめられています。