化学合成sgRNAとdCas9-SALL1-SDS3 lentiviral particlesを使用したCRISPRiワークフロー

細胞にCRISPRi dCas9-SALL1-SDS3 lentiviral particlesを形質導入し、‘CRISPRi ready’のdCas9-SALL1-SDS3安定発現細胞株を作製します。次に、ターゲット遺伝子に特異的なCRISPRi化学合成sgRNAを導入します。このシステムは、トランスフェクション可能な細胞モデルでのアレイ化スクリーニングに最適です。

lentiviral sgRNAとdCas9-SALL1-SDS3 lentiviral particlesを使用したCRISPRiワークフロー

CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3 lentiviral particlesを使用して安定したdCas9-SALL1-SDS3発現細胞株を確立し、CRISPRi lentiviral sgRNA粒子（左）またはプラスミドsgRNA（右）を導入するワークフローです。このシステムは、トランスフェクションが難しいタイプの細胞を扱う場合に理想的です。

dCas9-SALL1-SDS3を使用したCRISPRiは、dCas9-KRABを使用したCRISPRiよりも強力なタンパク質レベルの抑制をもたらす

TFRCの機能的ノックダウンは、hEF1αプロモーター下でdCas9-KRABまたはdCas9-SALL1-SDS3のいずれかを構成的に発現するU2OS細胞で評価されました。TFRCを標的とする3つのCRISPRi synthetic sgRNA（化学合成sgRNA）のプールフォーマット25 nMを、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して、細胞にトランスフェクトしました。トランスフェクションの72時間後に細胞を分割し、96時間後に細胞を固定し、TFRCを標的とする一次抗体とAlexa Fluor488標識蛍光二次抗体で染色しました。核の同定にはヘキスト染色を使用しました。

dCas9-SALL1-SDS3発現細胞は、dCas9-KRABと比較して、より大きく、より一貫性のあるCRISPRi遺伝子転写抑制を示す

CRISPRi化学合成sgRNAは、dCas9-KRABおよびdCas9-SALL1-SDS3発現細胞の両方で、トランスフェクション後48〜72時間で最大の転写抑制を達成します。dCas9-KRABまたはdCas9-SALL1-SDS3を安定して発現するU2OS細胞を、10,000細胞／ウェルでプレーティングし、CBX1、HBP1、またはSEL1LをターゲットとするCRISPRi synthetic sgRNA（化学合成sgRNA）のプールフォーマット25 nMを DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトしました。24、48、72、96、120、および144時間後に細胞を回収し、全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各標的遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いたΔΔCq法で計算し、non-targetingコントロール（NTC）に対して正規化しました。

LentiBOOST Lentivirus Transduction Enhancer is a uniquely formulated transduction reagent that can be used with or without lentivirus spinfection in order to increase successful viral transduction events while preserving cell viability. Especially critical for preserving precious primary cells from patient cohorts, or, for engineering complex animal models; improving transduction efficiency can save time and costs by increasing the success of each editing/transduction step, or, even avoid the loss of irreplaceable samples. Additionally, LentiBOOST technology is already used in the manufacturing of a number of clinical stage therapies providing the opportunity to demonstrate improved workflow applicability to the clinic.

LentiBOOST can be purchased through the Dharmacon Reagents catalog.

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Supporting Data

Improved CD8+ T-cell SMARTvector™ shRNA lentiviral system transduction using LentiBOOST™ Lentivirus Transduction Enhancer

100,000 primary human CD8+ T cells were transduced with either 30,000 (MOI 3, green) or 70,000 (MOI 7, purple) TUs of SMARTVector™ mCMV tGFP Lentiviral Control Particles targeting either NTC or PPIB along with 1:100 LentiBOOST transduction enhancer. Cells were centrifuged at 800 x g for one hour at 32 °C followed by a four hour incubation prior to removal of lentiviral particles and transduction enhancer. Transduction efficiency (%GFP+ out of live cells) and viability were determined 5 days post-transduction by flow cytometry. The addition of LentiBOOST technology markedly improved transduction efficiencies without significantly impacting cell viability.

Improved CD4+ and CD8+ T-cell Edit-R™ All-in-one sgRNA/Cas9 lentiviral system transduction using LentiBOOST™ Lentivirus Transduction Enhancer

100,000 primary human CD4+ and CD8+ T cells from two donors were transduced with 250,000 TUs of Edit-R GFP Delivery controls mCMV along with 1:100 LentiBOOST transduction enhancer. Cells were centrifuged at 800 x g for one hour at 32 °C followed by an overnight incubation prior to removal of lentiviral particles and transduction enhancer. Transduction efficiency and viability were determined 72 hours post-transduction by flow cytometry. The addition of LentiBOOST technology markedly improved transduction efficiencies without significantly impacting cell viability.

Improved transduction of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with the Strict-R™ Inducible CRISPRa lentiviral system transduction using LentiBOOST™ Lentivirus Transduction Enhancer

10,000 WTC hiPS cells were transduced with either 20,000 (MOI 2, green) or 40,000 (MOI 4, purple) TUs of Strict-R™ Inducible EGFP dCas9-VPR Lentiviral Particles along with 1:100 LentiBOOST transduction enhancer. Cells were centrifuged at 800 x g for one hour at 32 °C followed by an overnight incubation prior to removal of lentiviral particles and transduction enhancer. Transduction efficiency and viability were determined 72 hours post-transduction by flow cytometry. The addition of LentiBOOST markedly improved transduction efficiencies without significantly impacting cell viability.