dCas9-VPR安定発現細胞を用いたCRISPRaワークフロー

lentiviral dCas9-VPRと化学合成crRNA:tracrRNA（左）、またはlentiviral expressed sgRNA（右）を使用したCRISPR activationワークフロー

CRISPRa plasmidコトランスフェクションワークフロー

lentiviral dCas9-VPRと発現sgRNAのプラスミドの同時トランスフェクションのためのCRISPRaワークフロー

CRISPRaによる転写活性化倍率は内在性遺伝子発現レベルに依存する

基礎発現が低いかまったくない遺伝子は、強力なレベルまで活性化するのが簡単ですが、すでに高レベルで発現している遺伝子は、さらに過剰発現するのがより困難です。dCas9-VPR安定発現U2OS細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して、異なる基礎発現レベルの23種類の遺伝子を標的とするCRISPRa 化学合成crRNA:tracrRNAプール（25 nM）をトランスフェクトしました。トランスフェクションから72時間後に細胞を回収し、相対的な遺伝子発現を、RT-qPCRを使用して測定しました。CRISPRaを介した転写活性化の倍数は上のグラフに示しました。ここでは、NTCコントロールで処理されたサンプルにおける基本的な転写産物の発現レベルが低いものから高いものへと遺伝子が並べられています。下のグラフには、GAPDHコントロールと比較した標的遺伝子の基礎発現を示しています。

CRISPRa遺伝子の活性化は24時間で観察され、48〜72時間でピークになる

dCas9-VPR安定発現U2OS細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、EGFR、IL1R2、POU5F1、またはTFAP2Cを標的としたCRISPRa化学合成crRNA:tracrRNAを、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトしました。4種類のCRISPRaデザイン済みCRISPRa crRNAは、個別、またはプールフォーマットで使用しました（合計濃度：25 nM）。トランスフェクションの24、48、72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を計算しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。

LentiBOOST Lentivirus Transduction Enhancer is a uniquely formulated transduction reagent that can be used with or without lentivirus spinfection in order to increase successful viral transduction events while preserving cell viability. Especially critical for preserving precious primary cells from patient cohorts, or, for engineering complex animal models; improving transduction efficiency can save time and costs by increasing the success of each editing/transduction step, or, even avoid the loss of irreplaceable samples. Additionally, LentiBOOST technology is already used in the manufacturing of a number of clinical stage therapies providing the opportunity to demonstrate improved workflow applicability to the clinic.

LentiBOOST can be purchased through the Dharmacon Reagents catalog.

To learn more about LentiBOOST technology visit the Revvity LentiBOOST webpage.

Supporting Data

Improved CD8+ T-cell SMARTvector™ shRNA lentiviral system transduction using LentiBOOST™ Lentivirus Transduction Enhancer

100,000 primary human CD8+ T cells were transduced with either 30,000 (MOI 3, green) or 70,000 (MOI 7, purple) TUs of SMARTVector™ mCMV tGFP Lentiviral Control Particles targeting either NTC or PPIB along with 1:100 LentiBOOST transduction enhancer. Cells were centrifuged at 800 x g for one hour at 32 °C followed by a four hour incubation prior to removal of lentiviral particles and transduction enhancer. Transduction efficiency (%GFP+ out of live cells) and viability were determined 5 days post-transduction by flow cytometry. The addition of LentiBOOST technology markedly improved transduction efficiencies without significantly impacting cell viability.

Improved CD4+ and CD8+ T-cell Edit-R™ All-in-one sgRNA/Cas9 lentiviral system transduction using LentiBOOST™ Lentivirus Transduction Enhancer

100,000 primary human CD4+ and CD8+ T cells from two donors were transduced with 250,000 TUs of Edit-R GFP Delivery controls mCMV along with 1:100 LentiBOOST transduction enhancer. Cells were centrifuged at 800 x g for one hour at 32 °C followed by an overnight incubation prior to removal of lentiviral particles and transduction enhancer. Transduction efficiency and viability were determined 72 hours post-transduction by flow cytometry. The addition of LentiBOOST technology markedly improved transduction efficiencies without significantly impacting cell viability.

Improved transduction of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with the Strict-R™ Inducible CRISPRa lentiviral system transduction using LentiBOOST™ Lentivirus Transduction Enhancer

10,000 WTC hiPS cells were transduced with either 20,000 (MOI 2, green) or 40,000 (MOI 4, purple) TUs of Strict-R™ Inducible EGFP dCas9-VPR Lentiviral Particles along with 1:100 LentiBOOST transduction enhancer. Cells were centrifuged at 800 x g for one hour at 32 °C followed by an overnight incubation prior to removal of lentiviral particles and transduction enhancer. Transduction efficiency and viability were determined 72 hours post-transduction by flow cytometry. The addition of LentiBOOST markedly improved transduction efficiencies without significantly impacting cell viability.