CRISPRmod CRISPRi lentiviral sgRNAポジティブコントロール
遺伝子転写抑制実験の最適化のための検証済みCRISPRi lentiviral sgRNA
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遺伝子転写抑制実験の最適化のための検証済みCRISPRi lentiviral sgRNA
CRISPRi lentiviral sgRNAポジティブコントロールは、十分に特徴付けられたヒト遺伝子(PPIB1またはSEL1L)を選択的に転写抑制します。ポジティブコントロールは、標的遺伝子特異的ガイドRNAを用いた実験の前に、デリバリー条件とdCas9-SALL1-SDS3発現の最適化と継続的なモニタリングに推奨されます。
ポジティブコントロールに加えて、CRISPRi lentiviral sgRNA non-targetingコントロールを使用して、遺伝子発現のベースラインレベルを決定することをお薦めします。
dCas9-KRABまたはdCas9-SALL1-SDS3を安定して発現するU2OSおよびA549細胞を、24ウェルプレートに50,000細胞/ウェルでプレーティングし、PPIBあるいはSEL1LをターゲットとするCRISPRi sgRNAレンチウイルス粒子をMOI 0.3で形質導入して、単一のインテグラントを含む細胞を得ました。細胞を2 µg/mLピューロマイシンで5日間選択培養し、2つの集団に分割し、さらに1日回復培養しました。形質導入の7日後に、RT-qPCR分析のために1つの細胞集団を回収しました。もう1つの複製集団は、回収前にさらに7日間培養しました。回収したプレートから全RNAを単離し、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いたΔΔCq法で相対的な遺伝子発現を計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。