Edit-R lentiviral Cas9ヌクレアーゼ（A）とsgRNA（B）ベクターのベクターマップとベクターエレメント

Edit-R lentiviral CRISPR-Cas9プラットフォームは、Cas9発現を最大化するための複数のPol IIプロモーターオプションを持つレンチウイルスベクターと、目的の標的部位に設計されたsgRNA発現用の遺伝子特異的ベクターを利用する2ベクターシステムです。Edit-R lentiviral sgRNAベクターバックボーンでは、遺伝子特異的crRNAとtracrRNAがヒトU6プロモーターの制御下で発現され、一方、ピューロマイシン耐性マーカー（Puro^R）の発現はマウスCMVプロモーターから駆動され、統合sgRNAを持つ細胞の迅速な選択を可能にします。

Edit-R lentiviral sgRNAベクターのプラスミドベクターマップ

Edit-R lentiviral sgRNAベクターバックボーンでは、遺伝子特異的なcrRNAとtracrRNAがヒトU6プロモーターの制御下で発現します。一方、ピューロマイシン耐性マーカー（Puro^R）の発現はマウスCMVプロモーターから駆動され、sgRNAが組み込まれた細胞の迅速な選択を可能にします。このプラスミドには、大腸菌での増殖と選択のためのAmp^R耐性マーカーが含まれています。

Edit-R lentiviral sgRNAポジティブコントロールを使用した、異なるプロモーターの制御下におけるCas9の発現の違いによる、HEK293T細胞におけるさまざまなレベルのゲノム編集の検出

Edit-R lentiviral sgRNAポジティブコントロールとミスマッチ検出アッセイを使用して、HEK293T細胞におけるゲノム編集の効率をテストすると、hCMVおよびCAGプロモーターが最も高いレベルの編集をもたらすことが示されました。HEK293T細胞を、Cas9とブラステイジン耐性遺伝子を含むレンチウイルス粒子で安定的に形質導入しました。安定的に組み込まれた細胞集団は、sgRNAで形質導入する前に、最低10日間、blasticidinで選択しました。ポジティブコントロールsgRNAレンチウイルス粒子を低MOIで形質導入し、1つのインテグラントを持つ細胞を得、解析前に7日間ピューロマイシンで選択しました。T7エンドヌクレアーゼIを用いたDNAミスマッチ検出アッセイから、ピューロマイシン選択細胞におけるゲノム編集の相対頻度を算出しました。