dCas9-VPR安定発現細胞株を使用したCRISPRaワークフロー

Lentiviral dCas9-VPRと化学合成crRNA:racrRNA（左側）または lentiviral expressed sgRNA（右側）を使用したCRISPR activationワークフロー

CRISPRa plasmidコトランスフェクションワークフロー

dCas9-VPRとsgRNA のそれぞれレンチウイルス発現プラスミドをコトランスフェクションするCRISPRaワークフロー

dCas9-VPR安定発現細胞におけるlentiviral sgRNAによる効率的な遺伝子転写活性化

改変されたCRISPRa dCas9-VPRを安定して発現するU2OS、HEK293T、MCF 10A、およびK562を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、POU5F1またはTTNをターゲットとするCRISPRa sgRNAレンチウイルス粒子をMOI 0.3で形質導入して、単一の統合体を含む細胞を得ました。2 µg/mLのピューロマイシンで4日間細胞を選択た後、RT-qPCRで分析しました。。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算さし、non-targetingコントロールに対して正規化しました。

さまざまなCRISPRaガイドRNAタイプで実施された活性化の比較

化学合成crRNA:tracrRNAを使用したCRISPRa遺伝子転写活性化：細胞を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して、ASCL1、EGFP、POU5F1、およびTTN遺伝子を標的とするCRISPRa化学合成crRNA:tracrRNA（25 nM）をトランスフェクトしました。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を計算しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。

lentiviral sgRNA形質導入によるCRISPRa遺伝子転写活性化：細胞を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、ASCL1、EGFR、POU5F1、またはTTNを標的とするCRISPRa sgRNAレンチウイルス粒子をMOI 0.3で形質導入し、ゲノム当たり1コピーのsgRNAコンストラクトを含む細胞を得ました。細胞を2 µg/mLピューロマイシンで4日間選択した後、RT-qPCRで分析しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。

lentiviral sgRNA plasmidのトランスフェクションによるCRISPRa遺伝子転写活性化：細胞を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、DharmaFECT kbトランスフェクション試薬を使用して、ASCL1、EGFR、POU5F1またはTTNを標的とするCRISPRa sgRNAプラスミド（100ng）をトランスフェクトしました。ピューロマイシン選択せずに、トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を計算しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。