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CBEまたはABE向けカスタムPin-point sgRNAを設計・ご注文いただけます。
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Pin-point™塩基編集mRNA
Pin-point塩基編集mRNAは、Pin-point検証済みコントロールsgRNA、Pin-pointノンターゲティングコントロールsgRNA、またはカスタムPin-point sgRNAと組み合わせて使用することで、DNA二本鎖切断を誘導することなく、標的点突然変異の導入や遺伝子ノックアウトのための塩基編集を行うことができます。Pin-point nCas9およびデアミナーゼmRNAは、アデニン塩基編集（ABE）およびシトシン塩基編集（CBE）の両構成で提供されています。
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Pin-point塩基編集mRNAは、ニッカーゼCas9のDNA標的化能力と、アデニンまたはシチジンデアミナーゼによる塩基編集活性を利用し、Pin-point合成sgRNAと組み合わせて使用することで標的点突然変異を導入します。すべてのmRNAは、5-methoxy-uridine（5moU）修飾版または未修飾版から選択できます。 Pin-point ABE nCas9 mRNA Pin-point ABE nCas9 mRNAは、5’および3’核局在化シグナル（NLS）を有する Streptococcus pyogenes 由来ニッカーゼCas9（D10A）のヒトコドン最適化配列をコードしています。本mRNAはin vitro転写により調製され、CleanCap AGによりキャッピングされるとともに、ポリA化されています。翻訳後のタンパク質は核内へ局在します。 Pin-point ABE-flexおよびABE-exactデアミナーゼmRNA Pin-point ABE-flexおよびABE-exactデアミナーゼmRNAは、Profluent社の最先端AIモデルを活用して設計され、A-to-G塩基編集において良好な活性が得られることが生物学的に評価されています。本mRNAはin vitro転写により調製され、CleanCap AGによりキャッピングされるとともに、ポリA化されています。翻訳後のタンパク質は核内へ局在します。 Pin-point CBE nCas9 mRNA Pin-point CBE nCas9 mRNAは、5’および3’核局在化シグナル（NLS）を有する Streptococcus pyogenes 由来ニッカーゼCas9（D10A）に、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害因子（UGI）配列を融合したヒトコドン最適化配列をコードしています。本mRNAはin vitro転写により調製され、CleanCap AGによりキャッピングされるとともに、ポリA化されています。翻訳後のタンパク質は核内へ局在します。 Pin-point CBE rAPOBECデアミナーゼmRNA Pin-point CBE rAPOBECデアミナーゼmRNAは、5’核局在化シグナル（NLS）を有するアプタマー結合タンパク質とシチジンデアミナーゼ塩基編集酵素の融合体をコードしています。本製品は、幅広いヒト細胞種における塩基編集用途で評価されています。本mRNAはin vitro転写により調製され、CleanCap AGによりキャッピングされるとともに、ポリA化されています。翻訳後のタンパク質は核内へ局在します。 |
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Pin-pointプラットフォームによる塩基編集は、DNA二本鎖切断やindelを生じることなく、特定の塩基変換を誘導します。
本システムは、以下の3つの構成要素から成ります。
[1] ヌクレアーゼ活性を失わせたニッカーゼ（nCas9）。DNAの一本鎖のみを切断します。シトシン塩基編集（CBE）では、nCas9にウラシルDNAグリコシラーゼ阻害因子（UGI）配列が融合されています。一方、アデニン塩基編集（ABE）では、nCas9にUGIは融合されていません。
[2] アプタマー結合タンパク質と融合したシチジンデアミナーゼ（rAPOBEC）またはアデニンデアミナーゼ（ABE-flexまたはABE-exact）。rAPOBECは、プロトスペーサーのPAM遠位側に位置する編集ウィンドウ（4～8番目の塩基）内のC-G塩基対をT-A塩基対へ変換します。ABE-flexは塩基編集ウィンドウ内の4～8番目のA-T塩基対をG-C塩基対へ変換し、ABE-exactは5～6番目のA-T塩基対をG-C塩基対へ変換します。
[3] nCas9およびアプタマー-デアミナーゼ融合タンパク質を特定のDNA標的部位へ誘導するアプタマー型シングルガイドRNA（sgRNA）。
これら3つの構成要素を哺乳類細胞へ導入することで、標的部位で塩基編集が誘導されます。本システムは、早期終止コドンの導入、スプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位の破壊、あるいは点突然変異の導入による遺伝子ノックアウトに利用できます。遺伝子ノックアウト用sgRNAの設計には、Pin-point塩基編集sgRNAデザインツールをご利用ください。
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Pin-point塩基編集システムの模式図
UGI（赤）を融合した、または融合していないnCas9（薄灰色）を使用することで、DNA二本鎖切断を生じさせることなく塩基編集を行うことができます。そのため、DNA損傷応答経路は活性化されません。Pin-point sgRNAにはアプタマー（緑）が含まれており、アプタマー結合タンパク質（オレンジ）を介してデアミナーゼ（青：シチジンデアミナーゼ、水色：アデニンデアミナーゼ）を標的部位へ誘導することで塩基編集を実現します。
