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Pin-point™化学合成sgRNA検証済みコントロール
DNAの二本鎖切断を誘発することなく、正確な遺伝子編集を行うための最適なパラメータを検証するための、化学合成sgRNAコントロール
| Pin-point化学合成sgRNAは、crRNA、tracrRNA、および独自のアプタマー配列からなる128塩基キメラ融合体です。分子の5'末端と3'末端の両方がヌクレアーゼ耐性を持つように化学修飾されています。
sgRNAコントロールは、Pin-point nCas9およびPin-point Rat APOBEC mRNAを用いた塩基編集実験のポジティブコントロールとして推奨されます。 遺伝子特異的ポジティブコントロールおよびキットは、塩基編集および表現型タンパク質ノックアウトの評価用に設計および検証されています。以下のように構成されています：
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Pin-pointプラットフォームによる塩基編集は、DNAの二本鎖切断やインデル（indel）を形成することなく、特異的なヌクレオチド変化を誘導します。
このシステムは3つのコンポーネントから構成されています：
[1] DNAの一本鎖のみを切断または「ニッキング」するウラシルグリコシラーゼ（UGI）阻害剤と融合したヌクレアーゼ欠損「ニッカーゼ」nCas9（Komor, 2016）
[2] アプタマー結合タンパク質と融合したシチジンデアミナーゼ塩基編集酵素（Rat APOBEC）。シチジンデアミナーゼ酵素は、塩基対が編集ウィンドウ（プロトスペーサーのPAM遠位端の4から8位）内にある場合、C-G塩基対をT-A塩基対に変換します（Collantes, 2021）。
[3] nCas9とアプタマー：デアミナーゼ融合体を特定のDNA標的部位に誘導するアプタマー性シングルガイドRNA（sgRNA）。
哺乳類細胞に3つの構成要素すべてを導入することで、標的部位のC-GからT-Aへの塩基変換が誘導されます。このシステムは、遺伝子ノックアウト（未成熟終止コドンの導入（Billon, 2017）、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位の破壊（Webber, 2019））、または点突然変異の導入に使用できます。
Pin-point塩基編集システムの概要図
nCas9（薄い灰色）を利用することで、DNAの二本鎖切断が起こらず、DNA損傷応答経路がトリガーされません。Pin-point sgRNAにはアプタマー（緑）が含まれており、アプタマー結合タンパク質（オレンジ）を介してデアミナーゼ（青）をリクルートし、塩基編集を行います。
