Edit-R lentiviral sgRNAプール化スクリーニング用ライブラリー

アルゴリズムで最適化されたガイドRNAでライブラリーの特異性を確保します。細胞あたり1種類のsgRNA配列の発現で効率的なゲノム編集が行えます。

ノックアウトスクリーニング用の全ゲノム、druggableゲノム、遺伝子ファミリー、パスウェイライブラリー

注意事項：プール化ライブラリーは、新しく改良されたベクター・スキャフォールドで更新されました。ご不明な点がございましたら、Scientific supportまでお問い合わせください。

複数の自動化機器を導入せずに、偏りのない表現型のノックアウトスクリーニングを実行します。

プール化レンチウイルスライブラリーを用いたスクリーニングでは、DNAレベルで数百、さらには数千の遺伝子をノックアウトします。

CRISPRガイドRNAが標的DNAの二本鎖切断を引き起こし、タンパク質の機能的破壊を引き起こす能力は、ガイドRNA（gRNA）の配列と標的遺伝子内の標的位置によって異なります。これに対処するために、Dharmacon 試薬は、アルゴリズムを使用して、ヒトゲノムおよびマウスゲノムに対して高度に特異的で機能的なRNAガイドの設計をしています。

Edit-R CRISPR RNAアルゴリズムは、次のようなガイドRNA配列を生成します。

複数のミスマッチやギャップのあるアラインメントの検出を含む、迅速かつ徹底的な特異性分析を備えた最適化されたアラインメントプログラム
単なるindelの生成ではなく、遺伝子の機能的破壊に関連する特性を特定するための体系的な評価研究（1100を超えるガイドRNAを使用）により、標的遺伝子の機能的ノックアウトが増加

Highlights:

Cas9発現用のレンチウイルスベクターとsgRNA発現用の遺伝子特異的ベクターを利用した効率的な2ベクターシステム
合理的に設計されたEdit-RレンチウイルスsgRNAによる、機能的に検証された独自のアルゴリズムを使用して比類のない特異性を備えた効率的な遺伝子ノックアウト
ヒットの信頼性を高めるために、whole genomeライブラリーの場合、ヒトゲノム全体で遺伝子あたり 4あるいは8個の sgRNA、マウスゲノム全体では遺伝子あたり5～10個のsgRNAで深く広範囲にカバー
Edit-R Lentiviral Cas9 Nuclease Reagentsのプロモーターの柔軟性と組み合わせて、生物学的に関連する細胞タイプで強力な編集を行うことができます。

新しいEdit-R Human Lentiviral sgRNAプール化スクリーニング用ライブラリーには、プールごとに以下のものが含まれます。

≥ 5 x 10⁸ TU/mL ( ± 20%) レンチウイルス粒子の10 x 100 µL パックサイズ
NCBI Reference Sequence Databaseのタンパク質をコードする遺伝子を標的とする、遺伝子あたり4あるいは8個のsgRNA（全ゲノム）および最大8個のsgRNA（遺伝子ファミリーおよびパスウェイライブラリー）
最大100個のnon-targeting sgRNA陰性コントロールは、ヒトゲノムのどの遺伝子ともアライメントしない（標的としない）ことがバイオインフォマティクスにより確認されています。
遺伝子ファミリーおよびパスウェイライブラリーには、最大34のタンパク質コード遺伝子を標的とする最大340の遺伝子特異的sgRNA陽性コントロールが含まれます（各遺伝子につき10 sgRNA）。一般的な参照遺伝子（ACTB、GAPDH、LAMB1、PPIB）を含みます。
遺伝子アノテーション、sgRNA標的配列、コントロールの完全なリスト、およびマッッピングされた数百万リードあたりのカウントを含む、完全なライブラリー情報を含むデータファイル

Edit-R Mouse Lentiviral sgRNA Pooled Screening Librariesには、プールごとに以下のものが含まれます。

≥ 5 x 10⁸ TU/mL ( ± 20%) のレンチウイルス粒子の分注済みチューブ

5000以下のライブラリーコンストラクトの場合、8 x 25 µL（合計200 µL）
5000以上のライブラリーコンストラクトの場合、16 x 25 µL（合計400 µL）

NCBI Reference Sequence Databaseのタンパク質をコードする遺伝子を標的とする遺伝子あたり5～10個のsgRNA
100のnon-targeting sgRNAネガティブコントロールは、ヒト、マウスのゲノムのどの遺伝子とも一致しない（標的にしない）ことがバイオインフォマティクスで確認されています。
最大34のタンパク質コード遺伝子（遺伝子あたり10 sgRNA）を標的とする最大340の遺伝子特異的sgRNAポジティブコントロール。一般的なリファレンス遺伝子（ACTB、GAPDH、LAMB1、およびPPIB）を含みます。
完全なライブラリー情報を含むデータファイル（含：遺伝子注釈、sgRNA標的配列、コントロールの完全なリスト、およびマップされたリードの数百万あたりのカウント）

当社の検証済みプロトコルで推奨される製品：

ヒトおよびマウスライブラリー：
- ゲノム編集の検証および実験の最適化のための、ベクターに適合したEdit-Rレンチウイルス陽性およびnon-targeting sgRNAコントロール（推奨）
- 目的の細胞における相対的導入効率の決定および導入条件の最適化のための、最適プロモーターおよび蛍光レポーター（TurboGFPまたはTurboRFP）を有するSMARTvector Non-targetingコントロールパーティクル（推奨）
- Edit-R Lentiviral Cas9 ヌクレアーゼ試薬またはCas9安定細胞株
NEW V2バックボーンのヒトライブラリー：
- NGSヒット同定プライマー mCMV（必須）
  - バイアスを最小限に抑えた効率的なゲノムDNAのPCR増幅
  - NGSのランに多様性を付加するスタッガードフォワードプライマー
  - 部分的にIllumina®に互換性のあるTruSeq®アダプターの追加
V1バックボーンのマウスライブラリーおよびヒトライブラリー：
- Illumina®シーケンスプラットフォーム用Edit-R Mouse Pooled sgRNA Indexing PCR and Sequencing Primer Kit A（必須）
- リバースインデキシングPCRプライマー追加用Edit-R Mouse Pooled sgRNA Indexing PCR and Sequencing Primer Kit B（実験デザインにより追加のマルチプレキシング機能が必要な場合）
- Edit-R Lentiviral Cas9ヌクレアーゼ試薬またはCas9安定細胞株

重要なお知らせ

Edit-R Lentiviral sgRNAプール化スクリーニング用ライブラリーは、以下に記載されている封じ込め措置および適用される法律および規制が満たされている研究所での内部研究使用のみを目的としています（製品利用規約に規定されているとおり）。製品は、診断、治療、またはその他の商業目的で使用することはできません。また、ヒトに対してはいかなる目的であっても投与することはできず、動物に対しては治療目的で投与することはできません。レンチウイルス粒子として提供されるEdit-R Lentiviral sgRNAプール化スクリーニング用ライブラリーは、複製能力がなく、自己不活化（self-inactivating: SIN）であり、非病原性（感染性ヒト疾患を引き起こさない）です。

レンチウイルス粒子製品を購入する研究者は、レンチウイルスベクター粒子の取り扱いに関する特定のガイドラインについて、所属機関の健康およびバイオセーフティ担当者と相談する責任があります。さらに、各研究者は、複製能のないSINレンチウイルスベクターおよび複製欠損レンチウイルス粒子を使用した研究について、その地域の管轄区域および機関における必要な許可を取得する全責任を負います。

** 詳細については、Scientific supportまでお問い合わせください

ヒトまたはマウスEdit-R Lentiviral sgRNAプール化ライブラリーに含まれる標的遺伝子の数とレンチウイルスプール数


	Human		Mouse
Edit-R Lentiviral sgRNA Pooled Library¹	Number of targeted genes	Number of pools	Number of targeted genes	Number of pools x number of constructs per pool^2,3
Whole Genome	18890	1 pool	19683	19 pools x 10600 constructs
Druggable Genome	6411	1 pool	9827	10 pools x 10170 constructs
GPCR	470	1 pool	498	1 pool x 5311 constructs
Ion Channel	581	1 pool	340	1 pool x 3818 constructs
Protein Kinase	1139	1 pool	708	1 pool x 7451 constructs
Phosphatase	282	1 pool	269	1 pool x 3089 constructs
Protease	689	1 pool	533	1 pool x 5712 constructs
Ubiquitin Conjugate	564	1 pool	517	1 pool x 5564 constructs

Edit-R Human Whole Genomeライブラリーを用いたスクリーニングに必要なレンチウイルス粒子量

使用する細胞がHEK293Tと同じ相対形質導入効率を持つと仮定した場合、表示された倍数表現、生物学的複製、およびsgRNA/遺伝子に必要なHEK293T細胞における5×10⁸ TU/mLのレンチウイルス粒子量。スクリーニングに必要なレンチウイルス粒子の量は、CRISPR プール化スクリーニングプロトコールトラッキングワークシートを使用して計算できます。
Fold representation	Replicates	sgRNAs per gene	Volume of lentiviral particles
200	2	4	0.07 mL
200	2	8	0.13 mL
400	2	4	0.13 mL
400	2	8	0.25 mL

Edit-R Lentiviral sgRNAプール化スクリーニング用ライブラリーを使用した遺伝子ノックアウトスクリーニングワークフロー

Gene knockout screening workflow using the Edit-R Lentiviral sgRNA Pooled Screening Library platform

Cas9発現安定細胞株（混合またはクローン細胞集団）は、まずEdit-RレンチウイルスCas9 Nuclease粒子を使用して、ブラストサイジンで選択することにより作製します。次に、これらの細胞にレンチウイルスsgRNAプール化ライブラリーを導入し、ピューロマイシンで選択します。形質導入された細胞は、選択圧および／または表現型選択の適用のためにコントロール集団と実験集団に分割されます。次に、形質導入された細胞のコントロール集団および実験集団からゲノムDNAを抽出し、単離されたgDNA内のsgRNAコンストラクトをベクター特異的NGS Hit Identification Primerを用いて増幅します。その後、市販のIllumina TruSeq^®プレップキットを用いて、アンプリコンをインデックス化し、イルミナのプラットフォーム上でハイスループットシーケンス用に調製することができます。コントロールサンプルと実験サンプルの両方に組み込まれたsgRNAシーケンスが特定され、相対的な存在量が比較されます。濃縮または枯渇したsgRNAコンストラクトは、追加の表現型および／または生化学的アッセイで個々のEdit-RレンチウイルスsgRNAを使用して確認し、さらに研究するヒットとして同定されます。

Edit-RレンチウイルスCas9ヌクレアーゼおよびsgRNAのベクターマップ

Schematic maps of the Edit-R Lentiviral Cas9 Nuclease and sgRNA vectors

Edit-RレンチウイルスCas9ヌクレアーゼ（A）およびsgRNA（B）ベクターのベクターマップとベクター要素。最大のCas9発現のためのオプションと、目的の標的サイトに合わせて設計されたsgRNA発現のための遺伝子特異的ベクター。

高品質のプール化スクリーニングは、厳密なレンチウイルスsgRNAプール化ライブラリーの作製から始まる

高品質のプール化スクリーニングは、厳密なレンチウイルスsgRNAプール化ライブラリーの作製から始まります。ヒトキナーゼを標的とする7519個のレンチウイルスsgRNAで構成されるプール化ライブラリーを作製し、プラスミドDNAライブラリーの品質を次世代シーケンシング（NGS）によって検証しました。マッピングされたリード100万回あたりのカウントを取得して、入力sgRNAの回収率（99.5%）を決定しました。プール内のsgRNAの70%の存在量が互いに2.1倍の差であり、プール内のsgRNAの90%の存在量が互いに3.6倍の差であることを確認できました（パネルA.）。次に、プールしたプラスミドDNAライブラリーをレンチウイルス粒子にパッケージングし、MOI 0.3でU2OS細胞に形質導入し、形質導入後24時間（T0）にゲノムDNAを調製し、PCR増幅し、NGS用に準備しました。レンチウイルスsgRNAの分布は実質的に影響を受けず、厳密な生産と、生産からプール化スクリーニングへのコンストラクトの保持が最大化されたことを示しています（パネルB.）。

プール化レンチウイルスsgRNAヒトキナーゼライブラリースクリーニングは、信頼性の高い生存率のヒットを同定する

プール化レンチウイルスsgRNAヒトキナーゼライブラリースクリーニングは、信頼性の高い生存率のヒットを同定します。708のヒトキナーゼを標的とする7079のEdit-R sgRNA、34の必須遺伝子を標的とする340のポジティブコントロールsgRNA、および100のnon-targetingコントロールsgRNAで構成されるプール化レンチウイルスライブラリーを、MOI 0.3および1000倍のsgRNA representationでCas9発現U2OS細胞株に形質導入しました。2つの生物学的レプリケートを使用します。形質導入の24時間後に、コントロール細胞集団（T0）を採取し、実験細胞集団（T1）を2 ug/mLピューロマイシン処理（選択圧）にかけました。選択後８日目にT1細胞集団を採取しました。T0およびT1サンプルの両方からゲノムDNAを調製し、Edit-R Pooled sgRNAフォワードおよびリバースインデックスPCRプライマーを使用してPCR増幅し、Illumina社NGSでハイスループットシーケンスを行いました。sgRNAの存在量は、正規化されたカウントデータのMAプロットとして表示されます。有意に（adjusted p-value ≤ 0.05）量が多く、量が少なく、2倍以上の量の変化を示したsgRNAは、それぞれ赤と青です。緑色の線は、存在量の変化が0倍であることを示しています。