Edit-R lentiviral sgRNAプール化スクリーニング用ライブラリー

アルゴリズムで最適化されたガイドRNAでライブラリーの特異性を確保します。細胞あたり1種類のsgRNA配列の発現で効率的なゲノム編集が行えます。

ノックアウトスクリーニング用の全ゲノム、druggableゲノム、遺伝子ファミリー、パスウェイライブラリー

複数の自動化機器を導入せずに、偏りのない表現型のノックアウトスクリーニングを実行します

プール化レンチウイルスライブラリーを用いたスクリーニングでは、DNAレベルで数百、さらには数千の遺伝子をノックアウトします。

CRISPRガイドRNAが標的DNAの二本鎖切断を引き起こし、タンパク質の機能的破壊を引き起こす能力は、ガイドRNA（gRNA）の配列と標的遺伝子内の標的位置によって異なります。これに対処するために、Horizonは、アルゴリズムを使用して、ヒト、マウス、およびラットのゲノム全体に対して高度に特異的で機能的なRNAガイドの設計をしています。

Edit-R CRISPR RNAアルゴリズムは、次のようなガイドRNA配列を生成します。

複数のミスマッチやギャップのあるアラインメントの検出を含む、迅速かつ徹底的な特異性分析を備えた最適化されたアラインメントプログラム
単なるindelの生成ではなく、遺伝子の機能的破壊に関連する特性を特定するための体系的な評価研究（1100を超えるガイドRNAを使用）により、標的遺伝子の機能的ノックアウトが増加

Edit-R CRISPR RNAアルゴリズムを使用して、プール化レンチウイルススクリーニングに必要な、細胞あたり1種類のsgRNA配列の発現により非常に効率的な遺伝子ノックアウトを実現するレンチウイルスsgRNAを設計しました。

Highlights:

Cas9発現用のレンチウイルスベクターとsgRNA発現用の遺伝子特異的ベクターを利用した効率的な2ベクターシステム
合理的に設計されたEdit-RレンチウイルスsgRNAによる、機能的に検証された独自のアルゴリズムを使用して比類のない特異性を備えた効率的な遺伝子ノックアウト
ヒットの信頼性を高めるために、ヒト、マウス、ラットのゲノム全体で遺伝子あたり5～10個のsgRNAで深く広範囲にカバー
Edit-R Lentiviral Cas9 Nuclease Reagentsのプロモーターの柔軟性と組み合わせて、生物学的に関連する細胞タイプで強力な編集を行うことができます。

各Edit-R Lentiviral sgRNAプール化スクリーニング用ライブラリーに含まれるもの

≥ 5 x 10⁸ TU/mL（± 20 %）のレンチウイルス粒子の分注済みチューブ
- 5000以下のライブラリーコンストラクトの場合、8 x 25 µL（合計200 µL）
- 5000以上のライブラリーコンストラクトの場合、16 x 25 µL（合計400 µL）
NCBI Reference Sequence Databaseのコーディング遺伝子をターゲットとする遺伝子あたり5～10個のsgRNA
100のnon-targeting sgRNAネガティブコントロールは、ヒト、マウスのゲノムのどの遺伝子とも一致しない（標的にしない）ことがバイオインフォマティクスで確認されています。
最大34のタンパク質コード遺伝子（遺伝子あたり10 sgRNA）をターゲットとする最大340の遺伝子特異的sgRNAポジティブコントロール。一般的なリファレンス遺伝子（ACTB、GAPDH、LAMB1、およびPPIB）を含みます。
完全なライブラリー情報を含むデータファイル（含：遺伝子注釈、sgRNA標的配列、コントロールの完全なリスト、およびマップされたリードの数百万あたりのカウント）

Edit-R Lentiviral sgRNAプール化スクリーニング用ライブラリーは、ヒトおよびマウスの全ゲノムまでの遺伝子ファミリーの定義済みサブライブラリーに利用できます。カスタムEdit-RレンチウイルスsgRNAコレクションは、ご要望に応じてご利用いただけます。

ヒトまたはマウスの遺伝子ターゲティングsgRNAのカスタムコレクションを作成可能
50～10,000コンストラクトのプールサイズで利用可能
プールは、5 x 10⁸ TU/mL以上の精製濃縮レンチウイルス粒子として提供されます。

カスタムプール化ライブラリーのお見積リクエストはこちらから

当社の検証済みプロトコルで推奨される製品:

Edit-R Lentiviral sgRNAのトランスダクション最適化のためのnon-targetingコントロール
Edit-R Pooled sgRNA Indexing PCR and Sequencing Primer Kits（A&B）には、それぞれ12個の固有のインデックスプライマーが含まれており、最適化され、実験的に検証されています。
- バイアスを最小限に抑えた効率的なゲノムDNAのPCR増幅
- ヒット同定のためのIllumina社NGSフローセルでのハイスループットマルチプレックス次世代シーケンシング

Edit-R Lentiviral sgRNAプール化スクリーニング用ライブラリーのカバレッジに関する情報

プールあたりの遺伝子およびコンストラクトの数は、予告なしにいつでも変更される場合があります。ご要望に応じて、クローンおよび遺伝子カウントをご利用いただけます。

Collection	Human		Mouse
Edit-R Lentiviral sgRNA Pooled Library	# targeted genes	Number of pools and average constructs per pool	# targeted genes	Number of pools and average constructs per pool
Whole Genome	18,525	18 pools of 10,450 constructs	19,683	20 pools of 10,300 constructs
Druggable Genome	7359	7 pools of 10,730 constructs	9827	10 pools of 10,170 constructs
GPCR	378	1 pool of 4127 constructs	498	1 pool of 5311 constructs
Ion Channels	345	1 pool of 3829 constructs	340	1 pool of 3818 constructs
Protein Kinases	700	1 pool of 7262 constructs	708	1 pool of 7451 constructs
Phosphatases	247	1 pool of 2846 constructs	269	1 pool of 3089 constructs
Proteases	473	1 pool of 5080 constructs	533	1 pool of 5712 constructs
Ubiquitin Conjugation	564	1 pool of 5642 constructs	517	1 pool of 5564 constructs
Apoptosis	**
Cell Cycle Regulation	**
De-ubiquitinating Enzymes	**
Membrane Trafficking	**
DNA Damage Response	**
Epigenetics	**
Nuclear Receptor	**
Cytokine Receptors	**
Serine Proteases	**
Tyrosine Kinases	**

重要なお知らせ

Edit-R Lentiviral sgRNAプール化スクリーニング用ライブラリーは、以下に記載されている封じ込め措置および適用される法律および規制が満たされている研究所での内部研究使用のみを目的としています（製品利用規約に規定されているとおり）。製品は、診断、治療、またはその他の商業目的で使用することはできません。また、ヒトに対してはいかなる目的であっても投与することはできず、動物に対しては治療目的で投与することはできません。レンチウイルス粒子として提供されるEdit-R Lentiviral sgRNAプール化スクリーニング用ライブラリーは、複製能力がなく、自己不活化（self-inactivating: SIN）であり、非病原性（感染性ヒト疾患を引き起こさない）です。

レンチウイルス粒子製品を購入する研究者は、レンチウイルスベクター粒子の取り扱いに関する特定のガイドラインについて、所属機関の健康およびバイオセーフティ担当者と相談する責任があります。さらに、各研究者は、複製能のないSINレンチウイルスベクターおよび複製欠損レンチウイルス粒子を使用した研究について、その地域の管轄区域および機関における必要な許可を取得する全責任を負います。

** 詳細については、テクニカルサポートにお問い合わせください

Edit-R Lentiviral sgRNAプール化スクリーニング用ライブラリーを使用した遺伝子ノックアウトスクリーニングワークフロー

Cas9発現安定細胞株（混合またはクローン細胞集団）は、まずEdit-RレンチウイルスCas9 Nuclease粒子を使用して、ブラストサイジンで選択することにより作製します。次に、これらの細胞にレンチウイルスsgRNAプール化ライブラリーを導入し、ピューロマイシンで選択します。形質導入された細胞は、選択圧および／または表現型選択の適用のためにコントロール集団と実験集団に分割されます。次に、形質導入された細胞のコントロール集団および実験集団からゲノムDNAを抽出します。Edit-R Pooled sgRNA Indexing PCRプライマーを使用して、組み込まれたコンストラクトをPCRで増幅し、Illumina社NGSフローセル結合配列を付加します。得られたアンプリコンは、Edit-R Pooled sgRNA Read 1およびIndex Read Sequencingプライマーを使用して、Illumina社NGSでシーケンスされます。コントロールサンプルと実験サンプルの両方に組み込まれたsgRNAシーケンスが特定され、相対的な存在量が比較されます。濃縮または枯渇したsgRNAコンストラクトは、追加の表現型および／または生化学的アッセイで個々のEdit-RレンチウイルスsgRNAを使用して確認し、さらに研究するヒットとして同定されます。

Edit-RレンチウイルスCas9ヌクレアーゼおよびsgRNAベクターのベクターマップとベクター要素

Edit-RレンチウイルスCas9ヌクレアーゼ（A）およびsgRNA（B）ベクターのベクターマップとベクター要素。最大のCas9発現のためのオプションと、目的のターゲットサイトに合わせて設計されたsgRNA発現のための遺伝子特異的ベクター。

高品質のプール化スクリーニングは、厳密なレンチウイルスsgRNAプール化ライブラリーの作製から始まる

高品質のプール化スクリーニングは、厳密なレンチウイルスsgRNAプール化ライブラリーの作製から始まります。ヒトキナーゼを標的とする7519個のレンチウイルスsgRNAで構成されるプール化ライブラリーを作製し、プラスミドDNAライブラリーの品質を次世代シーケンシング（NGS）によって検証しました。マッピングされたリード100万回あたりのカウントを取得して、入力sgRNAの回収率（99.5%）を決定しました。プール内のsgRNAの70%の存在量が互いに2.1倍の差であり、プール内のsgRNAの90%の存在量が互いに3.6倍の差であることを確認できました（パネルA.）。次に、プールしたプラスミドDNAライブラリーをレンチウイルス粒子にパッケージングし、MOI 0.3でU2OS細胞に形質導入し、形質導入後24時間（T0）にゲノムDNAを調製し、PCR増幅し、NGS用に準備しました。レンチウイルスsgRNAの分布は実質的に影響を受けず、厳密な生産と、生産からプール化スクリーニングへのコンストラクトの保持が最大化されたことを示しています（パネルB.）。

プール化レンチウイルスsgRNAヒトキナーゼライブラリースクリーニングは、信頼性の高い生存率のヒットを同定する

プール化レンチウイルスsgRNAヒトキナーゼライブラリースクリーニングは、信頼性の高い生存率のヒットを同定します。708のヒトキナーゼをターゲットとする7079のEdit-R sgRNA、34の必須遺伝子をターゲットとする340のポジティブコントロールsgRNA、および100のnon-targetingコントロールsgRNAで構成されるプール化レンチウイルスライブラリーを、MOI 0.3および1000倍のsgRNA representationでCas9発現U2OS細胞株に形質導入しました。2つの生物学的レプリケートを使用します。形質導入の24時間後に、コントロール細胞集団（T0）を採取し、実験細胞集団（T1）を2 ug/mLピューロマイシン処理（選択圧）にかけました。選択後８日目にT1細胞集団を採取しました。T0およびT1サンプルの両方からゲノムDNAを調製し、Edit-R Pooled sgRNAフォワードおよびリバースインデックスPCRプライマーを使用してPCR増幅し、Illumina社NGSでハイスループットシーケンスを行いました。sgRNAの存在量は、正規化されたカウントデータのMAプロットとして表示されます。有意に（adjusted p-value ≤ 0.05）量が多く、量が少なく、2倍以上の量の変化を示したsgRNAは、それぞれ赤と青です。緑色の線は、存在量の変化が0倍であることを示しています。