CRISPRmod(CRISPRiおよびCRISPRa)実験では、効率的な転写調節のために、細胞内で2つのコンポーネントをデリバリーおよび/または発現させる必要があります。それは、遺伝子を標的とするガイドRNAと、転写リプレッサー(SALL1およびSDS3)またはアクチベーター(VPR)のいずれかに融合したヌクレアーゼ活性を不活性化したCas9(dCas9)です。いずれかの成分の量が不十分な場合、標的遺伝子の転写抑制または転写活性化が非効率的になるため、成功を確実にするために適切なコントロールを使用する必要があります。

コントロールは次の目的で使用する必要があります。

  • 化学合成ガイドRNAトランスフェクション条件の最適化
  • レンチウイルスdCas9発現を駆動するための最適なプロモーターの決定
  • dCas9mRNAによる最適なコトランスフェクション条件の特定
  • 実験の一貫性の確保、および考えられるバックグラウンド効果のコントロール

機能喪失実験のためのCRISPRiコントロール

最適な実験条件を確立し、継続的に成功する遺伝子転写抑制/活性化を確実にするために、特徴付けられた標的遺伝子に対してポジティブコントロールを使用することをお勧めします。

Non-targeting(ネガティブ)コントロールは、注釈付きのヒトゲノムに相補的な標的配列がないガイドRNAであるため、このコントロールによって特定の遺伝子のベースライン発現は変化しないことが期待されます。CRISPRmod実験では、mRNAとタンパク質のレベルが時間とともに変化する可能性があります。発現レベルを検出する際には、これを考慮に入れる必要があります。qPCRとウエスタンブロッティングを使用して、未処理およびnon-targetingコントロールと比較したmRNAおよびタンパク質レベルの変化を決定し、遺伝子発現調節効果を観察します。

CRISPRiコントロール

CRISPRi synthetic sgRNA(化学合成sgRNA)ポジティブコントロール
  • 遺伝子転写抑制の最適な実験条件の評価のためのプール化フォーマットまたは個別のsgRNAコントロール
CRISPRi synthetic sgRNA(化学合成sgRNA)non-targetingコントロール
  • 標的遺伝子特異的sgRNAの非存在下でCRISPRiコンポーネントに対するベースラインの細胞応答を評価します。
CRISPRi lentiviral sgRNAポジティブコントロール
  • 十分に特徴付けられた遺伝子を標的とする検証済みのsgRNAをポジティブコントロールして用いることで、実験条件の有効性を判断します。
CRISPRi lentiviral sgRNA non-targetingコントロール
  • 標的遺伝子特異的sgRNAの非存在下でCRISPRiコンポーネントに対するベースラインの細胞応答を評価します。

CRISPRaコントロール

CRISPRa synthetic crRNA(化学合成crRNA)ポジティブコントロール
  • 遺伝子転写活性化の最適な実験条件の評価のためのプールフォーマットまたは個別のcrRNAコントロール
CRISPRa synthetic crRNA(化学合成crRNA)non-targetingコントロール
  • 標的遺伝子特異的crRNAの非存在下でCRISPRaコンポーネントに対するベースラインの細胞応答を評価します。
CRISPRa lentiviral sgRNAポジティブコントロール
  • 十分に特徴付けられた遺伝子を標的とする検証済みのsgRNAをポジティブコントロールして用いることで、実験条件の有効性を判断します。
CRISPRa lentiviral sgRNA non-targetingコントロール
  • 標的遺伝子特異的sgRNAの非存在下でCRISPRaコンポーネントに対するベースライン細胞応答を評価するためのnon-targetingコントロール

All-in-one Controls

CRISPRi All-in-one Lentiviral sgRNA Positive Controls
  • All-in-one lentiviral sgRNAs targeting well-characterized genes to determine the effectiveness of your experimental conditions for maximum transcriptional repression.
CRISPRi All-in-one Lentiviral sgRNA Non-targeting Controls
  • Bioinformatically designed All-in-one Non-targeting sgRNA controls to evaluate baseline cellular responses to CRISPRi components in the absence of target-specific sgRNA.
CRISPRa All-in-one Lentiviral sgRNA Positive Controls
  • All-in-one lentiviral sgRNAs targeting well-characterized genes to determine the effectiveness of your experimental conditions for maximum activation.
CRISPRa All-in-one Lentiviral sgRNA Non-targeting Controls
  • Bioinformatically designed All-in-one Non-targeting sgRNA controls to evaluate baseline cellular responses to CRISPRa components in the absence of target-specific sgRNA.
CRISPRi化学合成sgRNAポジティブコントロールの確実なな遺伝子ノックダウン

Robust gene knockdown with CRISPRi synthetic sgRNA positive controls

dCas9-SALL1-SDS3 mRNAと化学合成sgRNAポジティブコントロールの同時デリバリーによる確実な転写遺伝子抑制。THP-1およびK-562細胞に、Lonza 2bシステムを使用して、dCas9-VPR mRNA(5 µg, Cat # CAS12024)、Puro dCas9-VPR mRNA(5 ug, Cat # CAS12026)、またはEGFP dCas9-VPR mRNA(5 µg, Cat # CAS12025)のいずれかと、化学合成tracrRNA(25 nM, Cat # U-002005-05)、およびTTNを標的とるするプールフォーマットのCRISPRa crRNA(5 uM, Cat # P-005395-01-0005)またはnon-targetingコントロール(NTC, 25 nM, Cat # U-009500-10-05)をエレクトロポレーションしました。トランスフェクションの48時間後に細胞を回収し、全RNAを単離しました。相対的な遺伝子発現は、RT-qPCRを使用して測定しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。


 

dCas9-VPR安定発現細胞における化学合成crRNA:tracrRNAによる効率的な遺伝子の転写活性化

Efficient transcriptional gene activation with synthetic crRNA:tracrRNA in dCas9-VPR stable cells

dCas9-VPR安定発現細胞における化学合成crRNA:tracrRNAによる効率的な遺伝子の転写活性化。dCas9-VPRを安定発現するように改変されたHEK293T、U2OS、MCF 10A、NIH/3T3を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、DharmaFECTトランスフェクション試薬を使用して、POU5F1およびTTNを標的とする化学合成crRNA:racrRNA(25 nM)をトランスフェクトしました。K562細胞には、POU5F1およびTTNを標的とする化学合成crRNA:tracrRNA(400 nM)をエレクトロポレーションしました。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各遺伝子の転写活性化倍率は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。


 

dCas9-VPR安定発現細胞株におけるレンチウイルスsgRNAによる効率的な遺伝子転写活性化

Efficient transcriptional gene activation with lentiviral sgRNA in dCas9-VPR stable cells

dCas9-VPRを安定発現するように改変されたU2OS、HEK293T、MCF 10A、およびK562を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、POU5F1またはTTNを標的とするsgRNAレンチウイルス粒子をMOI 0.3で形質導入して、単一の改変細胞を得ました。RT-qPCRで分析する前に、細胞を2 µg/mLピューロマイシンで4日間選択しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するΔΔCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。