CRISPRmod（CRISPRiおよびCRISPRa）実験では、効率的な転写調節のために、細胞内で2つのコンポーネントをデリバリーおよび/または発現させる必要があります。それは、遺伝子を標的とするガイドRNAと、転写リプレッサー（SALL1およびSDS3）またはアクチベーター（VPR）のいずれかに融合したヌクレアーゼ活性を不活性化したCas9（dCas9）です。いずれかの成分の量が不十分な場合、標的遺伝子の転写抑制または転写活性化が非効率的になるため、成功を確実にするために適切なコントロールを使用する必要があります。
コントロールは次の目的で使用する必要があります。
- 化学合成ガイドRNAトランスフェクション条件の最適化
- レンチウイルスdCas9発現を駆動するための最適なプロモーターの決定
- dCas9mRNAによる最適なコトランスフェクション条件の特定
- 実験の一貫性の確保、および考えられるバックグラウンド効果のコントロール
機能喪失実験のためのCRISPRiコントロール
最適な実験条件を確立し、継続的に成功する遺伝子転写抑制／活性化を確実にするために、特徴付けられた標的遺伝子に対してポジティブコントロールを使用することをお勧めします。
Non-targeting（ネガティブ）コントロールは、注釈付きのヒトゲノムに相補的な標的配列がないガイドRNAであるため、このコントロールによって特定の遺伝子のベースライン発現は変化しないことが期待されます。CRISPRmod実験では、mRNAとタンパク質のレベルが時間とともに変化する可能性があります。発現レベルを検出する際には、これを考慮に入れる必要があります。qPCRとウエスタンブロッティングを使用して、未処理およびnon-targetingコントロールと比較したmRNAおよびタンパク質レベルの変化を決定し、遺伝子発現調節効果を観察します。
CRISPRiコントロール
CRISPRi synthetic sgRNA（化学合成sgRNA）ポジティブコントロール
- 遺伝子転写抑制の最適な実験条件の評価のためのプール化フォーマットまたは個別のsgRNAコントロール
CRISPRi synthetic sgRNA（化学合成sgRNA）non-targetingコントロール
- 標的遺伝子特異的sgRNAの非存在下でCRISPRiコンポーネントに対するベースラインの細胞応答を評価します。
CRISPRi lentiviral sgRNAポジティブコントロール
- 十分に特徴付けられた遺伝子を標的とする検証済みのsgRNAをポジティブコントロールして用いることで、実験条件の有効性を判断します。
CRISPRi lentiviral sgRNA non-targetingコントロール
- 標的遺伝子特異的sgRNAの非存在下でCRISPRiコンポーネントに対するベースラインの細胞応答を評価します。
CRISPRaコントロール
CRISPRa synthetic crRNA（化学合成crRNA）ポジティブコントロール
- 遺伝子転写活性化の最適な実験条件の評価のためのプールフォーマットまたは個別のcrRNAコントロール
CRISPRa synthetic crRNA（化学合成crRNA）non-targetingコントロール
- 標的遺伝子特異的crRNAの非存在下でCRISPRaコンポーネントに対するベースラインの細胞応答を評価します。
CRISPRa lentiviral sgRNAポジティブコントロール
- 十分に特徴付けられた遺伝子を標的とする検証済みのsgRNAをポジティブコントロールして用いることで、実験条件の有効性を判断します。
CRISPRa lentiviral sgRNA non-targetingコントロール
- 標的遺伝子特異的sgRNAの非存在下でCRISPRaコンポーネントに対するベースライン細胞応答を評価するためのnon-targetingコントロール
CRISPRi化学合成sgRNAポジティブコントロールの確実なな遺伝子ノックダウン
dCas9-SALL1-SDS3 mRNAと化学合成sgRNAポジティブコントロールの同時デリバリーによる確実な転写遺伝子抑制。THP-1およびK-562細胞に、Lonza 2bシステムを使用して、dCas9-VPR mRNA（5 µg, Cat # CAS12024）、Puro dCas9-VPR mRNA（5 ug, Cat # CAS12026）、またはEGFP dCas9-VPR mRNA（5 µg, Cat # CAS12025）のいずれかと、化学合成tracrRNA（25 nM, Cat # U-002005-05）、およびTTNを標的とるするプールフォーマットのCRISPRa crRNA（5 uM, Cat # P-005395-01-0005）またはnon-targetingコントロール（NTC, 25 nM, Cat # U-009500-10-05）をエレクトロポレーションしました。トランスフェクションの48時間後に細胞を回収し、全RNAを単離しました。相対的な遺伝子発現は、RT-qPCRを使用して測定しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。
dCas9-VPR安定発現細胞における化学合成crRNA:tracrRNAによる効率的な遺伝子の転写活性化
dCas9-VPR安定発現細胞における化学合成crRNA:tracrRNAによる効率的な遺伝子の転写活性化。dCas9-VPRを安定発現するように改変されたHEK293T、U2OS、MCF 10A、NIH/3T3を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECTトランスフェクション試薬を使用して、POU5F1およびTTNを標的とする化学合成crRNA:racrRNA（25 nM）をトランスフェクトしました。K562細胞には、POU5F1およびTTNを標的とする化学合成crRNA:tracrRNA（400 nM）をエレクトロポレーションしました。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各遺伝子の転写活性化倍率は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。
dCas9-VPR安定発現細胞株におけるレンチウイルスsgRNAによる効率的な遺伝子転写活性化
dCas9-VPRを安定発現するように改変されたU2OS、HEK293T、MCF 10A、およびK562を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、POU5F1またはTTNを標的とするsgRNAレンチウイルス粒子をMOI 0.3で形質導入して、単一の改変細胞を得ました。RT-qPCRで分析する前に、細胞を2 µg/mLピューロマイシンで4日間選択しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するΔΔCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。