Lincode siRNA試薬

長鎖non-coding RNA（lncRNA）のノックダウン

独自のSMARTselectionアルゴリズムによりデザインされたsiRNAであり、ヒトの長鎖non-coding RNAを効果的にノックダウンするための特異性を高める修飾が施されています。デザイン済みLincode siRNAは、4種類のsiRNAを混合したSMARTpoolフォーマット、または1種類ごとの個別包装であるindividualフォーマットとして利用できます。

Lincode siRNA

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Lincode siRNA試薬は、長鎖non-coding RNA（lncRNA）の研究にとって重要なツールです。lncRNAは、その役割はまだ完全な解明が進みつつある新しい種類の制御分子です。デザイン済みのLincodeヒトsiRNA試薬は、専門家によるsiRNA設計と、特異性のための独自の二本鎖修飾という利点があります。ご利用にあたっては、目的遺伝子を検索し、利用可能な製品フォーマットと数量をご選択ください。

Highlights

Human RefSeq v.65の5867の特徴づけられたlncRNA（NR_およびXR_転写産物）に対してデザイン済みです。
Lincode siRNAは、独自の二本鎖化学修飾を行って、オフターゲットを低減するための最適な鎖のローディングを確保します。
SMARTpool試薬は、RNAiを介した分解の可能性を改善するためにlncRNAの複数の領域を標的とする技術です。

lncRNAノックダウン研究における信頼性の高いsiRNA試薬の重要性

lncRNAは、以下の理由により、タンパク質をコードする遺伝子よりもノックダウンが難しい場合があります。

IncRNAが核に局在する場合、RNAi細胞内機構による分解の可能性が低下します。
lncRNAの三次構造が、標的領域へのsiRNAのアクセスを妨げます。
DNAまたはタンパク質がlncRNAに結合し、siRNAが標的領域にアクセスするのを防ぎます。

製品フォーマット

SMARTpool：標的遺伝子に対して設計した配列の異なる4種類のsiRNAを1本のチューブに混合したフォーマット。ノックダウン効率と特異性の両方で優れています。
Set of 4：1つの遺伝子に対して設計した配列の異なる4種類のsiRNAをそれぞれ個別のチューブに入れ、チューブ4本で1セットとしたフォーマット
Individual siRNA：1種類（チューブ1本）ごとの個別包装で、実験に合わせて1つ、2つ、または3つの個々のsiRNAを選択できます。

lncRNAポジティブコントロールおよびnon-targetingコントロールの個別siRNAおよびプールフォーマットにより実験の信頼性を確認できます。Lincode Control siRNA試薬は、実験結果を改善するために特異性を高める修飾を組み込んでいます。

non-targeting siRNAは、ヒト、マウス、ラットのすべてのlncRNAおよびタンパク質をコードする転写産物に対して3つ以上のミスマッチがあるように設計されています。GAS5は広く発現しているlncRNAであり、そのノックダウンは複数の細胞株で実証されています。GAS5の発現レベルが細胞型で決定されていない場合は、ON-TARGETplus positive コントロールを代替使用し、実験の至適条件検討を行います。

Lincode Positive Control siRNA	Species	Catalog Number
Lincode GAS5 Control siRNA	Human	D-001310-01
Lincode GAS5 Control Pool	Human	D-001310-10
Lincode Negative Control siRNA	Species	Catalog Number
Lincode Non-targeting Control siRNAs	Human, Mouse, Rat	D-001320-0X
Lincode Non-targeting Pool	Human, Mouse, Rat	D-001320-10

Lincode siRNAはターゲットlncRNAを効果的にノックダウンする

Lincode SMARTpoolと4つのsiRNAによるHeLa細胞のBDNF-AS1のノックダウン。すべてのsiRNAを25nMで使用し、残りのlncRNA転写産物をSolaris（Thermo Scientificブランド）qPCR lncRNA発現アッセイで検出し、Non-targetingコントロールsiRNAに正規化しました。生存率はレサズリンアッセイによって評価しました。

Lincode siRNAの投与後の効果的なlncRNAノックダウンの検出

Lincode SMARTpoolと4つのsiRNAによるhNDF細胞でのCDKN2B-AS1のノックダウン。すべてのsiRNAを25 nMで使用し、lncRNA転写産物をSolaris qPCR lncRNA発現アッセイで検出し、non-targetingコントロールsiRNAに対して正規化しました。生存率はレザズリンアッセイによって評価されました。

lncRNAは非常に多様な発現を示す

lncRNAs demonstrate highly variable expression

lncRNAの発現レベルを正確に測定するには、堅牢なqPCRアッセイが必要です。

lncRNAは、タンパク質をコードする遺伝子よりも発現が低く、変動が大きいことを示しています。したがって、ノックダウン実験の前に、細胞内のlncRNA発現レベルを決定することを強くお勧めします。Solaris qPCR発現アッセイは、lncRNAの高感度検出用に設計されており、高感度と再現性を示します。

Maxima First Strand cDNA合成キット（＃K1641）を使用して、50 ngの全RNAをcDNAに変換しました。遺伝子発現レベルは、Solaris qPCRアッセイで評価しました。シクロフィリンB（PPIB）は、典型的なmRNA発現のリファレンスとして使用されました。標準的なRT-PCRサイクリング条件では、22（293T細胞のPPIB）から36（HeLa細胞のBDNF-AS1）の範囲の初期Cq値が得られました。MLK7-AS1 lncRNAの発現は、テストしたどの細胞株でも検出できませんでした。細胞株には、HeLa、HEK293T、ヒト新生児皮膚線維芽細胞（hNDF）が含まれます。

Lincodeの修飾により、機能が強化され、オフターゲットが低減される

Lincode siRNAは、BDNF-AS1 lncRNAを効果的にノックダウンしますが、lncRNAターゲットに対してアンチセンスであるタンパク質コード転写物BDNFはノックダウンしません。これは、Lincode siRNAの鎖特異性とON-TARGETplus修飾の有効性を示しています。siRNAを図に示された濃度でhNDF細胞に投与しました。BDNF-AS1およびBDNF転写産物は、Solaris qPCR発現アッセイで検出され、non-targeting siRNAに対して正規化されました。生存率はレザズリンアッセイによって評価され、未処理のサンプルに対して正規化されました。

Lincode siRNAの修飾により、オフターゲットが大幅に低減する

ゲノムワイドな発現解析により、Lincode siRNAの特異性が向上していることが示されています。

lncRNAノックダウンから生じる可能性のある微妙な表現型の変化を検出するには、タンパク質をコードする遺伝子のオフターゲットを防ぐための戦略を組み込むことが不可欠です。Lincode siRNA試薬は、ON-TARGETplus修飾パターンとして知られる独自の二本鎖修飾で合成されます。これは、siRNAのアンチセンス鎖のシード領域のmicro RNA様活性から生じるオフターゲットを減少させることが証明されています。

同じlncRNAを標的とする2つの異なるsiRNAは、（a）センス鎖のみをブロックする修飾、あるいは、（b）センス鎖をブロックする修飾に加えてアンチセンス鎖シード領域の修飾を含むON-TARGETplus修飾を導入して合成されました。ターゲットlncRNAは4つすべてのsiRNAによって効果的にサイレンシングされましたが（矢印）、ON-TARGETplus修飾で合成されたsiRNAはオフターゲットが大幅に減少したことを示しました。

Agilent™ G3Human Gene Expression Microarray™ HeLa12K、トランスフェクションの24時間後に回収、100 nM siRNA、分析：2倍ダウンレギュレーション、pval 0.05、および非siRNA特異的効果をフィルターで除去。

センス鎖の活性はsiRNAの修飾によって妨げられる

Lincode siRNAは、siRNAの機能を向上させる独自の二本鎖修飾が施されています。さらに、次の理由により、オフターゲットが削減されます。

パッセンジャー鎖活性の不活性化により、ガイド鎖をRISCに優先的にロードする
microRNA様のオフターゲットを破壊するために、シード領域に化学修飾が施されている