相同組換え修復（Homology-directed repair: HDR）は、切断部位に隣接する領域と十分な相同性を持つドナーテンプレートの存在に依存しています。相同性アームの長さとドナーのタイプ（ssDNAオリゴまたはプラスミド）は、正確な修飾のタイプとサイズに依存します。Figure 1は、タグや制限酵素部位などの短いDNA領域を挿入するためのドナーオリゴの使用を示しています。Edit-R HDR Donor Designerを使用すると、ドナーオリゴのカスタマイズを簡単に行うことができます。
短いDNA配列を正確に挿入するためのドナーオリゴ
Figure 1. 蛍光マーカーなどのより大きな挿入の場合、効率的な組み換えをサポートするために適切な長さの相同性アームを備えたドナープラスミドテンプレートが必要です。Edit-R HDR DNA Plasmid donor kitとEdit-R HDR Donor Designerは、ドナープラスミドの設計と組み立てを迅速かつ簡単に行うことができます。
蛍光選択マーカー挿入のためのドナープラスミドアセンブリ
Figure 2. 蛍光選択マーカー挿入のためのドナープラスミドアセンブリ
ドナーDNAオリゴ濃度の最適化
U2OS細胞に、Cas9発現プラスミドおよび、EMX1 crRNA:tracrRNA、30ヌクレオチドの相同性アームを持つ様々な濃度のドナーDNAオリゴを、DharmaFECT Duoトランスフェクション試薬を使用してコトランスフェクトしました。あるいは、Cas9が組み込まれたU2OS細胞株に、EMX1を標的としたcrRNA:tracrRNAおよび30ヌクレオチドの相同性アームを持つ様々な濃度のドナーDNAオリゴをトランスフェクトしました。RFLPアッセイを使用して、各トランスフェクションにおけるドナーDNAオリゴの各濃度におけるHDRノックインの量を測定しました。データは、3つの独立したトランスフェクションからのものです。
最大のHDRノックインのための相同性アーム長の最適化
Cas9が組み込まれたU2OS細胞株に、EMX1またはVCPを標的とするcrRNA:tracrRNAとドナーDNAオリゴを、DharmaFECT Duoトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトしました。相同性アームの長さが異なる複数のドナーDNAオリゴを使用しました。RFLPアッセイを3つの独立したトランスフェクションで行い、各相同性アーム長のドナーDNAオリゴにおけるHDRベースのノックインを測定しました。
VCP遺伝子座でのゲノム編集
Cas9ヌクレアーゼ発現試薬とVCP遺伝子座を標的とした化学合成crRNA:tracrRNAを用いて、U2OS細胞のHDRゲノムエンジニアリングを行いました。
A. VCP遺伝子座のDNA配列。エクソンは青いボックスで示されます。化学合成crRNAのガイド配列は灰色ハイライトで、PAMは赤字で、切断部位は青矢印で示しています。挿入配列は青色で表示しています。
B. Cas9発現プラスミドを導入後ピューロマイシン選択なし（No selection）、ピューロマイシン選択あり（Puro selection）、Cas9を予め発現する細胞（Cas9 integrated）、またはトランスフェクトされていない細胞（Untransfected）のミスマッチ検出分析を使用したインデル（indel）変異効率の分析。編集率はゲルの下に示しています。
C. 30ヌクレオチドの相同性アームDNAオリゴを使用して導入されたHindIIIおよびNheI制限酵素部位のHDR挿入効率の分析。HDR編集の割合は、VCP PCRアンプリコンのNheI消化を伴うRFLPアッセイを使用して計算しました。co-Tfx =コトランスフェクション
EMX1遺伝子座でのゲノム編集
Cas9ヌクレアーゼ発現試薬とEMX1遺伝子座を標的とした化学合成crRNA:tracrRNAを用いて、U2OS細胞のHDRゲノムエンジニアリングを行いました。
A. MX1遺伝子座のDNA配列。エクソンは青いボックスと大文字で、イントロンは小文字で示しています。crRNAのガイド配列は灰色ハイライトで、PAMは赤字で、切断部位は青矢印で示しています。挿入配列は青色で、内在性の終止コドンは緑色で示しています。
B. Cas9発現プラスミドを導入後ピューロマイシン選択なし（no selection）、ピューロマイシン選択あり（Puro selection）、Cas9を予め発現する細胞（Cas9 integrated）、またはトランスフェクトされていない細胞（Untransfected）のミスマッチ検出分析を使用したインデル（indel）変異効率の分析。編集率はゲルの下に示しています。
C. 30ヌクレオチドの相同性アームDNAオリゴを使用して導入されたHindIIIおよびNheI制限酵素部位のHDR挿入効率の分析。HDR編集の割合は、EMX1 PCRアンプリコンのNheI消化を使用したRFLPアッセイを使用して計算しました。co-Tfx =コトランスフェクション
Edit-R HDRプラスミドドナーのクローニングに必要なマテリアル
HDRプラスミドドナーの作製と組み立てに必要なコンポーネントの図。これは、長さが500〜1000 bpの2つの相同性アームに隣接する目的の蛍光タグ（mKate2）を含むように構築されています。必要なカタログ製品およびカスタムコンポーネントは次のとおりです。
- Edit-R HDR mKate2 insert
- Edit-R HDR plasmid donor backbone
- Edit-R colony PCR primer backbone forward & reverse A
- Edit-R colony PCR primer mKate2 forward & reverse B
- Edit-R custom HA primer forward & reverse 1 – designed with the HDR Donor Designer
- Edit-R custom HA primer forward & reverse 2 – designed with the HDR Donor Designer
