HDRノックインテンプレート

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ゲノム編集
ゲノム編集試薬
HDRノックインテンプレート

CRISPRガイドRNAはCas9ヌクレアーゼをプログラムし、特定の場所でゲノムDNAを切断します。二本鎖切断（DSB）が生じると、哺乳類細胞は内因性メカニズムを利用してDSBを修復します。ssDNAオリゴまたはプラスミドドナーのいずれかのドナーDNAの存在下で、DSBはHDRを使用して正確に修復でき、目的のゲノム変化（挿入、欠失、または置換）をもたらします。

HDRドナーテンプレートの設計を開始する

CRISPR Design Tool

カスタムガイドRNAを注文するか、使いやすいインターフェースを使用して独自の化学合成sgRNA、crRNA、またはlentiviral sgRNAを設計および注文します。
HDR Donor Designer

30以上の異なる種で、HDRを介した遺伝子編集用のカスタムドナーオリゴまたはプラスミドを設計および注文できます。

相同組換え修復（HDR）は、切断部位に隣接する領域と十分な相同性を持つドナーテンプレートの存在に依存しています。相同性アームの長さとドナーのタイプ（ssDNAオリゴまたはプラスミド）は、行われる正確な修飾のタイプとサイズに依存します。Figure 1は、タグや制限酵素部位などの短いDNA領域を挿入するためのドナーオリゴの使用を示しています。Edit-R HDR Donor Designerを使用すると、ドナーオリゴのカスタマイズを簡便に行うことができます。

短いDNA配列を正確に挿入するためのドナーオリゴ

Figure 1. 蛍光マーカーなどのより大きな挿入の場合、効率的な組換えをサポートするために適切に長い相同性アームを備えたドナープラスミドテンプレートが必要です。Edit-R HDR DNA Plasmid donor kitとEdit-R HDR Donor Designerを併用すると、ドナープラスミドの設計と組み立てのプロセスが迅速かつ簡単になります。

蛍光選択マーカーを挿入するためのドナープラスミドアセンブリ

Figure 2. 蛍光マーカーを挿入するためのドナープラスミドアセンブリ

HDRドナーテンプレートのデザインと注文用ツール

Edit-R HDR Donor Designer - oligo

挿入、欠失、またはその他の変更のための一本鎖DNAドナーオリゴ（≤150nt）を設計し、注文することができます。
Edit-R HDR Donor Designer - plasmid

mKate2またはEGFP蛍光マーカー、またはカスタムインサートを挿入するためのプラスミドDNAドナーキットを設計し、注文することができます。

HDR Donor Template Kits

Edit-R HDR Plasmid Donor Kits

HDR用のプラスミドドナーを迅速かつ簡単に組み立てることができます。
Edit-R HDR Plasmid Donor Components

Edit-Rプラスミドドナーキットのベクターバックボーンおよびインサートコンポーネントのみをご提供しています。
Edit-R HDR Plasmid Donor Primers

Edit-RプラスミドドナーキットのPCRコンポーネントのみをご提供しています。

ドナーDNAオリゴ濃度の最適化

U2OS細胞に、Cas9発現プラスミドおよび、EMX1 crRNA:tracrRNA、30ヌクレオチドの相同性アームを持つ様々な濃度のドナーDNAオリゴを、DharmaFECT Duoトランスフェクション試薬を使用してコトランスフェクトしました。あるいは、Cas9が組み込まれたU2OS細胞株に、EMX1を標的としたcrRNA:tracrRNAおよび30ヌクレオチドの相同性アームを持つ様々な濃度のドナーDNAオリゴをトランスフェクトしました。RFLPアッセイを使用して、各トランスフェクションにおけるドナーDNAオリゴの各濃度におけるHDRノックインの量を測定しました。データは、3つの独立したトランスフェクションからのものです。

最大のHDRノックインのための相同性アーム長の最適化

Cas9が組み込まれたU2OS細胞株に、EMX1またはVCPを標的とするcrRNA:tracrRNAとドナーDNAオリゴを、DharmaFECT Duoトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトしました。相同性アームの長さが異なる複数のドナーDNAオリゴを使用しました。RFLPアッセイを3つの独立したトランスフェクションで行い、各相同性アーム長のドナーDNAオリゴにおけるHDRベースのノックインを測定しました。

VCP遺伝子座での遺伝子編集

Cas9ヌクレアーゼ発現試薬とVCP遺伝子座を標的とした化学合成crRNA:tracrRNAを用いて、U2OS細胞のHDRゲノムエンジニアリングを行いました。
A. VCP遺伝子座の概略図。エクソンは青いボックスで示されます。化学合成crRNAのガイド配列は灰色ハイライトの領域、PAMは赤字、切断部位は青矢印で示されています。挿入配列は青色で表示されています。
B. Cas9発現プラスミドを導入後ピューロマイシン選択なし（No selection）およびあり（Puro selection）の細胞、またはCas9を予め発現する細胞（Cas9 integrated）、およびトランスフェクトされていない細胞（Untransfected）を、ミスマッチ検出分析を使用してインデル（indel）変異効率を分析しました。編集率はゲルの下に示されています。
C. 30ヌクレオチドの相同性アームDNAオリゴを使用して導入されたHindIIIおよびNheI制限酵素部位のHDR挿入効率を分析しました。HDR編集の割合は、VCP PCRアンプリコンのNheI消化を伴うRFLPアッセイを使用して計算されました。

co-Tfx =コトランスフェクション

EMX1遺伝子座での遺伝子編集

Cas9ヌクレアーゼ発現試薬とEMX1遺伝子座を標的とした化学合成crRNA:tracrRNAを用いて、U2OS細胞のHDRゲノムエンジニアリングを行いました。
A. EMX1遺伝子座の概略図。エクソンは青いボックスと大文字で示されます。イントロンは小文字で示されます。crRNAのガイド配列は灰色ハイライトの領域、PAMは赤字、切断部位は青矢印で示されています。挿入配列は青色で示され、内因性終止コドンは緑色で示されています。
B. Cas9発現プラスミドを導入後ピューロマイシン選択なし（No selection）およびピューロマイシン選択あり（Puro selection）の細胞、またはCas9を予め発現する細胞（Cas9 integrated）、およびトランスフェクトされていない細胞（Untransfected）を、ミスマッチ検出分析を使用してインデル（indel）変異効率を分析しました。編集率はゲルの下に示されています。
C. 30ヌクレオチドの相同性アームDNAオリゴを使用して導入されたHindIIIおよびNheI制限酵素部位のHDR挿入効率を分析しました。HDR編集の割合は、EMX1 PCRアンプリコンのNheI消化を使用したRFLPアッセイを使用して計算されました。