Cas9ヌクレアーゼ

Cas9 mRNAデータ

Cas9安定発現細胞株にEdit-R化学合成sgRNAを用いた効率的なindel形成

接着性Cas9安定細胞株を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、PPIB（カタログ番号：U-009000-01-XX）を標的とする化学合成sgRNA（25 nM）を含むDharmaFECT 1またはDharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して逆トランスフェクトしました。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、indel形成の相対効率を、non-targetingコントロール（NTC、カタログ番号：U-009501-01-XX）と比較した微量分解（TIDE）を使用して評価しました。サスペンションCas9 Stable Cell Linesは、PPIB（カタログ番号：U-009000-01-XX）をターゲットとする化学合成sgRNA（5 µM）を使用して、100,000細胞／ウェル、およびLonzaバッファーSEまたはSFをそれぞれ使用してエレクトロポレーションしました。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、indel形成の相対効率を、non-targetingコントロール（NTC、カタログ番号：U-009501-01-XX）と比較した微量分解（TIDE）を使用して評価しました。

蛍光Cas9 nuclease mRNAは編集効率を維持する

トランスフェクションの24時間前に、U2OS細胞を10,000細胞／ウェルで黒色の96ウェルプレートに播種しました。トランスフェクション時に、EGFP Cas9 nuclease mRNA（200 ng、カタログ番号：CAS11860）または非蛍光Cas9 nuclease mRNA（200 ng、カタログ番号：CAS11195）を、Edit-R PPIB化学合成crRNAコントロール（25 nM、カタログ番号：U-007000-01-05）およびtracrRNA（25 nM、カタログ番号：U-002005-05）と共に、DharmaFECT Duoトランスフェクション試薬（0.3 µL/ウェル）を使用して共導入しました。24時間後、Nikon Eclipse Ti-S/L100倒立顕微鏡を使用して、細胞のEGFP蛍光を画像化しました（A）。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、DNAミスマッチ検出アッセイによってゲノム編集を測定しました（B）。

蛍光Cas9 nuclease mRNAは最適なトランスフェクション条件を示す

ユビキチンタグ付きEGFPを発現するU2OS細胞を、黒色の96ウェルプレートに10,000細胞／ウェルで播種し、Cas9 mRNA（200 ng、カタログ番号：CAS11859）とともに、既知のプロテアソーム成分であるPSMD11（25 nM、カタログ番号：CM-085161-03）を標的とする化学合成crRNA、化学合成tracrRNA（25 nM、カタログ番号：U-002005- 05）をコトランスフェクションしました。Non-targetingコントロール（NTC、カタログ番号：U-007501-xx）をネガティブコントロールとして使用しました。ウェルあたりのDharmaFECT Duoトランスフェクション試薬の量を変えてテストしました（0.1 µL～0.7 µL）。24時間後、細胞はIn Cell Analyzer 2200を使用してmKate2蛍光について画像化しました。トランスフェクションの72時間後、細胞はプロテアソームノックアウトから生じるEGFP蛍光について画像化しました。mKate2蛍光から、最適なトランスフェクション条件は、DharmaFECT Duoがウェルあたり0.3～0.4 μLである時であることがわかりますが、これは表現型効果の増加に対応しています。DharmaFECT Duoがウェルあたり0.4 μLを超えると、有意な細胞死が観察されます（グラフ、赤ボックス）。 UT = untransfected sample

Cas9 proteinデータ

Nucleofection of CD4+ primary human T-cells with Edit-R Cas9 Protein Hybrid NLS RNPs

CD4+ cells were stimulated with CD3/CD28 T-cell activation beads (BioLegend) at a 1:1 bead:T-cell ratio and grown for 8 days with 30 U/mL of IL-2. The Lonza 4D shuttle system was used to nucleofect RNPs composed of Edit-R Cas9 Protein Hybrid NLS and Edit-R synthetic guide RNA individual and target pools for CXCR3 (Gene ID: 2833) and CD3D (Gene ID: 915). Functional knockout was measured by flow cytometry analysis of target prevalence for CXCR3 (Clone ID: G025H7) and CD3D (Clone ID: OKT3) (BioLegend). Representative flow cytometry analysis plots of CD4+ T-cells shown after target knockdown by RNP nucleofection.

Lentiviral Cas9データ

蛍光Lentiviral Cas9ヌクレアーゼにより、高発現細胞の濃縮とCRISPR-Cas9ゲノム編集効率の向上が可能

U2OS 細胞に、Edit-R Lentiviral hCMV mKate2-Cas9ヌクレアーゼ粒子（カタログ番号：VCAS11869)）を低感染多重度（MOI = 0.3）で形質導入し、形質導入された細胞にCas9が1つだけ組み込まれるようにしました。細胞をFACS解析のために増殖し、細胞集団をmKate2蛍光negative、low、medium、highに分けソーティングしました。これらの亜集団を増殖し、96ウェルプレートに10,000細胞／ウェルで播種しました。1日後、tracrRNA（25 nM、カタログ番号：U-002005-xx）、および Edit-R PPIB Synthetic crRNA Control（カタログ番号：U-007501-xx）または Edit-R MYC Predesign crRNA（カタログ番号：CM- 003282-01）DharmaFECT 1トランスフェクション試薬（0.3 µL/ウェル、カタログ番号：T-2001-01）を使用してトランスフェクトしました。 72時間後、In Cell Analyzer 2200（GE Healthcare; A）を使用して細胞をmKate2蛍光について画像化し、DNAミスマッチ検出アッセイのために収集して、ゲノム編集を評価しました (B)。mKate2の高発現は、PPIBおよびMYCを標的とするcrRNAのより高いゲノム編集効率と関連づけられると思われます。

Cas9ヌクレアーゼ

‘CRISPR-ready’の改変済みCas9発現細胞株

• Cas9安定発現細胞株
  

  機能喪失研究用のCRISPRガイドRNAを導入する準備ができている細胞株です。汎用されるさまざまな細胞タイプのCas9安定発現細胞株をご用意しています。

DNA-freeワークフローのための一過的なCas9ヌクレアーゼ

• Cas9 nuclease mRNA
  

  Cas9ヌクレアーゼの一過的な発現用に精製されたCas9 mRNAです。ソーティング、濃縮、視覚化に利用できる蛍光オプションも選択可能です。

• Edit-R Cas9 Protein Hybrid NLS

  New! Purified ready-to-use Cas9 protein with a new and improved NLS composition enabling more efficient nuclear delivery for rapid RNP workflows

• Cas9 nuclease protein NLS
  

  DNA-freeの実験ワークフローのためのready-to-useの精製Cas9タンパク質です。

Cas9発現細胞株を作製するためのベクターベースのソリューション

• Lentiviral Cas9 nucleases試薬
  

  Cas9ヌクレアーゼ安定発現細胞株を作製するための精製レンチウイルス粒子またはプラスミドDNAです。構成的または誘導的プロモーターを選択可能です。

Solutions for generating inducible Cas9 expressing cell-lines

• Strict-R inducible Cas9 lentiviral system

Lentiviral Cas9 system for dual controlled gene knockout in diverse cell types.

CRISPR ガイドRNA

Edit-R化学合成ガイドRNAおよびコントロール

• Synthetic sgRNA（化学合成sgRNA）

  目的の遺伝子を編集（DNA切断）することが保証されたゲノムワイドにご用意しているデザイン済み化学合成sgRNAです。デザインアルゴリズムは、厳密な特異性チェックを通じてオフターゲット編集を最小限に抑えながら、機能的なタンパク質ノックアウトの可能性を最大化します。

  • 化学合成sgRNAポジティブコントロールおよび検出プライマー

    十分に特徴付けられた遺伝子を標的とする種特異的な化学合成sgRNAおよびミスマッチ検出アッセイプライマーであり、ゲノム編集効率を最大化する実験条件を検討するために使用します。

  • 化学合成sgRNA non-targetingコントロール

    標的遺伝子特異的sgRNAの非存在下でCRISPR-Cas9コンポーネントに対するベースラインの細胞応答を評価するために使用します。

• Synthetic crRNA（化学合成crRNA）

  標的遺伝子の編集（DNA切断）が保証されています。アルゴリズムで最適化されたcrRNAであり、ヒトおよびマウスの遺伝子をゲノムワイドに網羅しています。ヌクレアーゼ耐性の向上のために、化学修飾が導入されています。

• 化学合成tracrRNA

  Trans-activating CRISPR RNA（tracrRNA）は、化学合成crRNAと組み合わせて用い、Cas9ヌクレアーゼによる編集を行う「ガイドRNA複合体」を形成します。

Edit-RレンチウイルスsgRNA＆コントロール

• all-in-one e lentiviral sgRNA + Cas9

  Cas9とsgRNAを一つのベクターから発現させ、効率的な遺伝子ノックアウトと高い特異性を実現します。グリセロールストックおよび高力価精製レンチウイルス粒子をご用意しています。

  • all-in-one  lentiviral sgRNAポジティブコントロールおよびキット

    all-in-one  lentiviral sgRNA用コントロールにより、DNA二本鎖切断とゲノム編集効率を検証します。

  • all-in-one  lentiviral sgRNA non-targetingコントロール

    ヒト、マウス、またはラットのゲノム内の遺伝子を標的としないようにバイオインフォマティクスによって設計および検証されているall-in-one  lentiviral sgRNAコンストラクトです。

• Lentiviral sgRNA

  アルゴリズムで最適化されたsgRNAであり、ヒトまたはマウスの遺伝子をゲノムワイドに網羅しています。目的の標的遺伝子の編集（DNA切断）が保証されています。グリセロールストックおよび高力価精製粒子をご用意しています。

  • Lentiviral sgRNAポジティブコントロール

    十分に特徴付けられた遺伝子を標的とする種特異的なsgRNAを使用して、ゲノム編集効率を最大化する実験条件を検討するため使用します。

  • Lentiviral sgRNA non-targetingコントロール

    標的遺伝子特異的sgRNAの非存在下でCRISPR-Cas9コンポーネントに対するベースラインの細胞応答を評価するために使用します。

カスタムガイドRNAデザイン

• CRISPR Design Tool

  配列既知のカスタムガイドRNAを注文するか、使いやすいインターフェースを使用して研究にユニークな化学合成sgRNAやcrRNA、またはレンチウイルスsgRNAをデザインおよび注文できます。

Edit-R HDRドナーテンプレートのデザイン、注文ツールおよびキット

• HDR Donor Designer - oligo

  挿入、欠失、またはその他の改変のための一本鎖DNAドナーオリゴ（≤150nt）をデザインし、注文することができます。

• HDR Donor Designer - plasmid

  mKate2またはEGFP蛍光マーカー、またはカスタムインサートを挿入するためのプラスミドDNAドナーキットをデザインし、注文することができます。

• HDR plasmid donor kits

  HDR用のプラスミドドナーを迅速かつ簡単に組み立てることができます。

• HDR plasmid donor components

  HDRドナープラスミドを迅速かつ効率的に構築します。

• HDR plasmid donor primers

  Edit-R Plasmid Donor KitのPCRコンポーネントのみをご提供しています。

Dharmacon Edit-R保証

すべてのデザイン済みEdit-RガイドRNAは、Edit-Rテクニカルマニュアルの記載に従い細胞導入した場合に、標的領域で編集（DNA切断）ができることを保証されています。

Edit-R ガイドRNA保証は、野生型S. pyogenes 由来Cas9ヌクレアーゼ（タンパク質、mRNA、発現用プラスミド、または発現用レンチウイルスベクター）とともに使用した場合に適用されます。更にEdit-R化学合成crRNAは、Edit-R tracrRNAとともに使用した場合に適用されます。

T7EIまたはSurveyorミスマッチ検出アッセイを使用して、試薬で処理された細胞集団の編集（DNA切断）の分析結果を提示する必要があります。同時並行で適切に実施されたEdit-R ポジティブコントロールが編集（DNA切断）に成功する一方で、Edit-Rデザイン済みガイドRNAによる編集（DNA切断）が成功しない場合、同じフォーマットで同じ容量の、異なるEdit-R デザイン済みガイドRNAの交換製品が、1回限り無償で提供されます。

交換製品の提供は、テクニカルサポートチームとの話し合いでのみ承認されます。

DNAレベルでの編集（切断）の成功は、常に機能的な遺伝子ノックアウトにつながるとは限りません。複数のガイドRNAをテストして、標的遺伝子のノックアウトに最も効果的なガイドRNAを決定することをお薦めします。

この保証は付随する実験費用には適用されず、CRISPR Design Toolを介して注文されたガイドRNAには適用されず、また本保証により交換したガイドRNAには適用されません。