私たちのテクニカルサポートチームは、たびたび、実験のin vivoフェーズに移行する研究者からガイダンスや提案を求められます。さまざまな研究が行われているため、簡単な答えはありません。ただし、普遍的な考慮事項はあります。in vivo実験用にオリゴを注文する際に考慮すべきいくつかの重要なポイントをご説明します。
1. ヌクレアーゼ耐性にはどのような修飾を使用する必要がありますか？
オリゴの安定性は、実験を成功させるために重要です。デリバリー方法と環境を考慮に入れる必要があります。次のような複数の戦略があります。
- siRNAの場合、Horizonが占有するAccellやsiSTABLE等のデザイン済みのものが一般的な選択肢ですが、カスタマイズされた修飾パターンも利用できます。
- すべての他のオリゴについては、2'OMe、2'F、ホスホロチオエート、または他のを使用する戦略が適切な場合があります。
アプリケーションに推奨されるパターンについては、文献を参照することをお勧めします。
2. オリゴによる毒性を回避するにはどうすればよいですか？
in vivo実験に必要な、適切な対イオンの存在および高濃度におけるオリゴ溶解性を確保するために、 合成後処理（in vivo処理）を採用することをお勧めします。さらに、無菌ろ過とエンドトキシンレベルのチェックにより、研究の被移植動物の安全性が保証されます。
- in vivo処理には、塩とエンドトキシンが安全なレベル内にあることを確認するためのイオン交換、ろ過、脱塩、およびエンドトキシンテストのステップが含まれます。
- in vivo HPLCは、上記のすべての手法を採用しており、修飾RNAアプリケーション（色素、GalNAcなどの追加）用に、さらなる精製ステップとしてHPLCを追加します。
さらなる文書化またはテストが必要な場合は、所属機関の審査委員会に確認することをお勧めします。
3. どのくらいの量を注文すればいいですか？
必要なオリゴの最終量を決めるための3つの主要な決定要因があります。最終的には、研究全体に必要な十分量を一度に注文することをお勧めします。そうすれば、コホートのすべての個体に全体を通して同一の処理をすることができます。
- 動物モデルのサイズ
- 研究の被移植動物の数
- デリバリー方法／生体内分布
量を決定したら、Horizonのウェブサイトのcalculatorを用いてnmolからmgに変換し、分子量変換が計算通りであることをダブルチェックしてください。
4. どの配列を使用する必要がありますか？
カタログsiRNAまたは他のRNA配列は、in vivoで標的とされる細胞株に近い細胞株を用いて、先にin vitroでのパイロット研究でテストする必要があります。これは、動物実験に必要な大規模なカスタム合成の前に、配列を検証して選択するための手頃な最初のステップです。
5. 実験にどのようなコントロールを含める必要がありますか？
- ポジティブコントロールは、効果を生み出すことが知られているものであり、デリバリーシステムが機能していることを示します。
- ネガティブコントロールは、効果を示さず、すべてのターゲット特異的RNAを比較できるベースラインとなるものでなければなりません。
- MockはRNAオリゴの溶解に用いた溶液のみであり、投与方法や配送方法による影響がないことを示すために使用します。
最終的に、Horizon Discoveryには、ニーズに合わせてさまざまな修飾、処理オプション、および合成スケール があります。ウェブサイトに必要なものが表示されない場合、または最終的な金額がオンラインで利用可能なスケールを超えている場合は、必ずテクニカルサポートにご連絡ください。
Author:
Jennifer Abarca Ph.D. | Lead Scientific Support Specialist
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