耐性と感受性のスクリーニングをめぐる考察とそれぞれに適切なモダリティ

ポジティブセレクションスクリーニング：耐性スクリーニング

研究者の目的が耐性ヒット（すなわち、ノックアウト（CRISPRko）、ノックダウン（CRISPRi）、過剰発現（CRISPRa）すると、耐性スクリーニングが進むにつれて濃縮される、細胞のフィットネスが改善された表現型が生じるような遺伝子）を見つけることである場合、致死量に近い高い薬物圧をかけ、理想的には70-90％の間の適切な増殖阻害条件を設定します（Figure 1）。こうすることで、薬剤耐性をもたらす特定の変異を持つ細胞が生き残る可能性が高くなり、薬剤感受性の高い細胞と比較して、細胞集団全体に濃縮されることになります。このことは、NGS解析によって、薬剤処理した細胞集団とコントロールのエンドポイント細胞集団との比較によって検出されます。

耐性スクリーニングは、遺伝子プロファイルに基づいて患者を層別化し、適切な治療群に割り当てるためのマーカーを同定するなど、薬剤開発パイプライン全体で利用することができます。さらに、耐性遺伝子の同定は、耐性表現型を克服するための組み合わせ治療戦略の開発を助けることができます。

ネガティブセレクションスクリーニング：感受性スクリーニング

研究者の目的が感受性のヒット（すなわち、ノックアウト（CRISPRko）、ノックダウン（CRISPRi）、過剰発現（CRISPRa）すると、感受性のスクリーニングが進むにつれて枯渇する、細胞のフィットネスが低下する表現型が生じるような遺伝子）を見つけることである場合、10-30％程度の増殖阻害を生じるように、適度に低い薬物圧をかけなければなりません。というのも、感受性あるいはネガティブセレクションスクリーニングでは、使用する薬剤の影響に対する感受性が高まるために、集団から失われつつある表現型を見つけることを目的としているからです ¹。常に小さな薬物圧をかけることで、感受性スクリーニングに理想的なアッセイウインドウが得られます（Figure 1）。これは、成長阻害に測定可能な影響を与えることで標的の関与を確信できる一方、低い薬物圧で薬物に対して最も感受性の高い摂動のみを同定できるためです。

感受性あるいはネガティブセレクションスクリーンでは、スクリーニングの質を向上させるために、遺伝子あたりのガイド数が多いライブラリーを選択することが有益です ¹。

薬剤開発パイプラインにおいて、感受性スクリーニングは、薬剤の効果に対して耐性細胞を感受性化する遺伝子摂動を同定するのに有用であり、その結果、複数の治療戦略間の相乗効果が示唆され、また、選択された治療が有効な患者の同定にも役立ちます。

その他の検討事項

効果的なネガティブまたはポジティブスクリーニング投与量を同定するためには、スクリーニング前の評価が極めて重要であり、適切なスクリーニング圧を同定するために、対象化合物を用いた複数投与量レジメン（複数回、長期間にわたる投与）を徹底的に検討し、細胞株の経時的応答を理解する必要があります。

感受性スクリーニングを行う場合、薬剤に感受性のある遺伝子変異を同定するために推奨される10～30％の増殖阻害を用いると、耐性スクリーニングに適切な薬剤圧（約70～90％の増殖阻害）でスクリーニングを行った場合よりも信頼性は低くなるものの、早期の耐性ヒットを同定できる可能性があります。感受性スクリーニングから得られた追加の耐性ヒットは、しばしば既知の標的に対する薬効を確認することができます（薬物標的をノックアウトすることで、薬物に対する耐性が発現し始めると予想されます）。

反対に、耐性スクリーニングから得られた感受性のヒットを分析することは、耐性条件を引き起こすために使用される薬剤の圧力が高く、集団から脱落する遺伝子を検出するための最適なウィンドウを得ることと相反するため、通常はそれほど有益ではありません（Figure 1）。

Figure 1 ポジティブセレクションスクリーニングでは、高い薬剤圧（70-90％のGI）の時に薬剤耐性遺伝子の濃縮を探し、これが耐性ヒットを同定する最適なウィンドウを作ります。ネガティブセレクションスクリーニングでは、細胞集団から脱落した遺伝子を検出するためのウィンドウを最大化するために、薬剤圧を10-30％と低くします。