遺伝子ターゲットの機能評価は、機能喪失研究によって行われるのが一般的です。特に、RNA干渉（RNAi）、CRISPRベースの遺伝子編集（CRISPRノックアウト）、CRISPR干渉（CRISPRi）が用いられます。各技術は、標的遺伝子を減弱させるために適用される場合、それぞれ特有の強みを持ちますが、同時に一連の制約や考慮事項も伴います。直交性機能喪失（loss-of-function: LOF）法を並行して組み合わせること（直交性バリデーション）は、偽陰性や偽陽性の可能性を排除するのに役立ちます。このように、直交バリデーションは十分にデザインされ、コントロールされた実験に不可欠な要素です。 相乗的試験のさらなる利点は、特定のLOF手法のユニークな特性（効果速度論、標的欠損の程度など）により、標的遺伝子のさらなる特性が明らかになる可能性があることです。
遺伝子機能を破壊するために直交技術を並行して使用することで、それぞれが異なる作用機序を持ち、アプリケーション特有の利点や考慮事項があるため、（1つの方法論だけと比較して）効果的なターゲットバリデーションが可能となります。
直交バリデーションには以下のような利点があります：
- 実験的アーチファクトによる偽の結果の同定と排除
- 特定の方法論に固有の実験的困難の影響の低減
- 結果の検証と科学的厳密性の向上
- 新たな遺伝子機能や特性を発見する可能性の向上
ここでは、間葉系から上皮系への移行（mesenchymal-to-epithelial transition: MET）の維持に関与する遺伝子を対象に、直交標的検証戦略を採用した研究を紹介します。間葉系から上皮系への移行（MET）は、腫瘍転移の逆パラダイムと考えられることがあります。間葉系細胞は無定形、非構造、遊走性、浸潤性であり、上皮系細胞は構造化され、非浸潤性、非遊走性、良好に固定されます。このプロセスは、転移性の表現型から、静止状態を維持する表現型へと変化します。METはまた、間葉系腫瘍細胞がより上皮的な状態に戻って増殖し、二次的な部位で増殖を形成する転移性コロニー形成においても中心的な役割を果たしているようです。
この研究では、3つの標的指向性LOFプラットフォームが、METを取り巻く2つの表現型の特徴である細胞遊走と接着マーカーのレベルで評価され、培養細胞で測定されました。 このマルチプラットフォーム直交セットアップを用いて、METの4つの重要な制御因子（ZEB1、ZEB2、PI3Ka、AKT2）における標的遺伝子ノックダウンとノックアウトを検証し、比較しました。
直交LOFフレームワークを用いることにより、我々は以下のことを行いました：
- RNA転写産物レベル（RNAiとCRISPRi）とインデル（indel）形成による遺伝子破壊（CRISPRノックアウト）だけでなく、すべての方法と遺伝子ターゲットで有意に減少したタンパク質について、3つのLOFプラットフォームを検証しました。
- すべての直交法が間葉系細胞株において細胞遊走を効果的に調節できることを見いだし、機能レベルで技術を検証しました。
- ある種の接着マーカーは、時間的属性および／または遺伝子標的レベルのいずれかにより、試験したLOFプラットフォームに特異的な反応を示すことが確認されました。
まとめると、LOFプラットフォーム間の裏付けを可能にすることで、直交バリデーションはこれらの実験結果に対する信頼性を生み出しました。加えて、直交検証の枠組みを採用することで、単一のLOF技術を用いた場合には見過ごされていたかもしれない知見も明らかになりました。
この研究の詳細については、直交検証アプリケーションノートをご覧ください。
