Edit-R デザイン済みガイドRNA保証

すべてのデザイン済みEdit-RガイドRNAは、Edit-Rテクニカルマニュアルの記載に従い細胞導入した場合に、標的領域で編集（DNA切断）ができることを保証します。

Edit-RガイドRNA保証は、野生型S. pyogenes由来Cas9ヌクレアーゼ（タンパク質、mRNA、発現用プラスミド、または発現用レンチウイルスベクター）とともに使用した場合に適用されます。更にEdit-R 化学合成crRNAは、Edit-R tracrRNAとともに使用した場合に適用されます。

T7EIまたはSurveyorミスマッチ検出アッセイを使用して、試薬で処理された細胞集団の編集（DNA切断）の分析結果を提示する必要があります。同時並行で適切に実施されたEdit-R ポジティブコントロールが編集（DNA切断）に成功する一方で、Edit-Rデザイン済みガイドRNAの編集（DNA切断）が成功しない場合、同じフォーマットで同じ容量の、異なるEdit-Rデザイン済みガイドRNAの交換製品が、1回限り無償で提供されます。

交換製品の提供は、テクニカルサポートチームとの話し合いでのみ承認されます。

DNAレベルでの編集（切断）の成功は、常に機能的な遺伝子ノックアウトにつながるとは限りません。複数のガイドRNAをテストして、標的遺伝子のノックアウトに最も効果的なガイドRNAを決定することをお勧めします。

この保証は付随する実験費用には適用されず、CRISPR Design Toolを介して注文されたガイドRNAには適用されず、また本保証により交換したガイドRNAには適用されません。

Edit-R all-in-one lentiviral sgRNAシステムを用いた遺伝子ノックアウトワークフロー

混合集団（左側）またはクローン細胞株（右側）の実験アプローチを用いたall-in-one lentiviral sgRNAによる遺伝子ノックアウトワークフロー

Edit-R all-in-oneレンチウイルスシステムを用いた場合の編集頻度（TIDE）

JurkatまたはK562細胞に、CD3またはCD28遺伝子のいずれかを標的とするEdit-R All-in-one EGFPレンチウイルスsgRNAベクターを用いて、0.3 MOIで形質導入しました。all-in-oneレンチウイルス粒子は、hEF1αまたはmCMVプロモーターの下で構成的にCas9ヌクレアーゼを発現します。Non-targetingコントロール（NTC）ガイドを発現するレンチウイルス粒子をネガティブコントロールとして使用しました。レンチウイルスの形質導入と増殖の後、細胞をソーティングせず細胞集団（Pool）として分析するか、またはソーティングを行って、最も明るい（Top）または最も暗い（Dim）EGFP発現細胞集団を濃縮しました。次に、細胞のPool、Top、およびDimの集団をTIDE分析にかけ、ゲノム編集の割合を評価しました。

Edit-Rの 2ベクターシステムとall-in-oneシステムの比較

2ベクターシステムの場合、hEF1αまたはmCMVの制御下でCas9を構成的に発現するためのレンチウイルス粒子を細胞に0.3 MOIで形質導入し、10 µg/mLブラストサイジンで10日間選択した後、all-in-one Non-targetingコントロール（NTC）あるいは、DNMT3BまたはPPIBをターゲットとするsgRNAレンチウイルス粒子を0.3 MOIで形質導入しました。all-in-oneシステムでは、all-in-one Non-targetingコントロール（NTC）あるいは、DNMT3BまたはPPIBをターゲットとするall-in-oneレンチウイルスsgRNAを野生型細胞に0.3 MOI にて形質導入し、2 µg/mLピューロマイシンで3日間選択しました。次に、細胞を溶解し、T7EIを用いたDNAミスマッチ検出アッセイを使用してindel（挿入・欠失）を分析しました。

Edit-R all-in-one Lentiviral sgRNAのベクターマップ

Edit-R all-in-one Lentiviral sgRNAベクターバックボーンでは、遺伝子特異的ガイドRNAはヒトU6プロモーターの制御下で発現し、Cas9およびピューロマイシン耐性マーカー（Puro^R）またはEGFPマーカーの発現はヒトEF1αまたはマウスCMVプロモーターのいずれかから駆動されます。プラスミドには、大腸菌での増殖と選択のためのアンピシリン耐性マーカーが含まれています。