SMARTvector Inducible Lentiviralコントロール

遺伝子発現調節試薬
RNA干渉
shrna
SMARTvector Inducible Lentiviralコントロール

SMARTvector Inducible Lentiviralコントロール

SMARTvector Inducible shRNAを用いた実験の正確なデータ解釈を可能にするコントロール

SMARTvector Inducible RNAiコントロールは、遺伝子特異的なSMARTvector Inducible Lentiviral shRNA実験の前に、最適なデリバリー条件を決定するための費用対効果の高いツールです。shMIMIC Inducible Lentiviral microRNAのコントロールとしても使用できます。

遺伝子特異的なコンストラクトのSMARTvector Inducible Lentiviral shRNAまたはshMIMIC Inducible Lentiviral microRNAを注文する際には、目的の遺伝子を検索し、ご希望のプロモーターとレポーターを選択します。

プロモーターとレポーターが同一のSMARTvector InducibleネガティブおよびポジティブRNAiコントロールの使用により、SMARTvector Inducible shRNAおよびshMIMIC Inducible Lentiviral microRNAの両方の正確なデータ解釈が可能になります

SMARTvector Inducible RNAiコントロールは、遺伝子特異的SMARTvector Inducible Lentiviral shRNAおよびshMIMIC InducibleLentiviral microRNAを使用する前に、デリバリーおよびドキシサイクリン誘導の最適条件を決定するためのコスト効率の高いツールです。

初めに、SMARTchoice Inducible Non-targeting Control 4-Packを使用して、細胞に最適なベクター構成を特定してください。

SMARTchoice Inducible Non-targeting Control 4-Pack（カタログ番号：VSC6847）を使用して、4つのプロモーターを同時に評価することにより、ご使用の細胞において最もアクティブなプロモーターを決定します。

高力価の濃縮および精製されたレンチウイルス粒子の4つの試料（各25 µL）のセットです。
TurboGFP蛍光レポーターとそれぞれmCMV, PGK, hEF1α, mEF1αプロモーターを備えたSMARTvector Inducible Non-targetingコントロールが含まれます。
ピューロマイシン耐性遺伝子およびTet-On 3Gトランスアクチベータータンパク質の発現を促進する最適なプロモーターの定性的、経験的評価を可能にします。

ご注文時は、SMARTvector inducible RNAiコントロールは、遺伝子特異的コンストラクトと同一のプロモーターとレポーターを選択してください。

SMARTvector Inducibleベクターコントロールは、4つのプロモーターと2つの蛍光レポーターまたは蛍光レポーター非搭載から選択できます。個々のコントロールはすべて大腸菌グリセロールストック、または精製・濃縮されたパッケージング済みレンチウイルス粒子((50 µL (2 x 25 µL), 1 x 10⁷ TU/mL ± 20%)で提供しています。

SMARTvector Inducible non-targetingコントロール

ヒト、マウス、ラットの既知の遺伝子を標的としないように設計されており、遺伝子特異的効果を正規化できるベースラインを提供します。
形質導入効率と目的の細胞への形質導入の影響を評価するのに役立ちます。

実験的な考慮事項：

SMARTvector Inducible non-targetingコントロール 1：Horizonで最も長く、最も一般的に使用されているSMARTvector non-targetingコントロールです。ほとんどの実験をサポートするのに理想的です。
SMARTvector Inducible non-targeting 2～12：フォローアップ実験で異なる non-targetingコントロールシーケンスを使用する必要がある場合用に特別に設計されています。複数のコントロールが必要な場合にご選択ください。

SMARTvector Inducibleポジティブコントロール

必須ではなく大量に発現するハウスキーピング遺伝子の一貫した強力なノックダウンにより、形質導入効率と遺伝子ノックダウンを確認できます。
SMARTvector Inducible GAPDポジティブコントロール：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）をターゲットとし、ノックダウン検証済みのSMARTvector Inducible Lentiviral shRNA
SMARTvector Inducible PPIBポジティブコントロール：peptidylprolyl isomerase B（cyclophilin B）をターゲットとし、ノックダウン検証済みのSMARTvector Inducible Lentiviral shRNA

SMARTvector Inducible Non-targetingコントロールshRNA

SMARTvector Inducible RNAi Experimental Control	Reporter	RNA Pol II Promoter	Catalog Number
SMARTvector Inducible Non-targeting Control	TurboGFP	mCMV	VSC6570
		hEF1α	VSC6572
		mEF1α	VSC6574
		PGK	VSC6580
	TurboRFP	mCMV	VSC6571
		hEF1α	VSC6573
		mEF1α	VSC6575
		PGK	VSC6581

SMARTvector Inducible RNAi 実験用コントロール

SMARTvector Inducible RNAi Experimental Control	Reporter	RNA Pol II Promoter	Catalog Number
SMARTvector Inducible RNAi Experimental Control	Reporter	RNA Pol II Promoter	Human	Mouse	Rat
SMARTvector Inducible GAPDH Positive Control shRNA	TurboGFP	mCMV	VSH6542	VSM6390	VSR6420
		hEF1α	VSH6544	VSM6392	VSR6422
		mEF1α	VSH6546	VSM6394	VSR6444
		PGK	VSH6552	VSM6416	VSR6446
	TurboRFP	mCMV	VSH6543	VSM6391	VSR6421
		hEF1α	VSH6545	VSM6393	VSR6423
		mEF1α	VSH6547	VSM6395	VSR6445
		PGK	VSH6553	VSM6417	VSR6447
			Human	Mouse	Rat
SMARTvector Inducible PPIB (Cyclophilin B) Positive Control shRNA	TurboGFP	mCMV	VSH6530	VSM6562	VSR6592
		hEF1α	VSH6532	VSM6564	VSR6727
		mEF1α	VSH6534	VSM6576	VSR6729
		PGK	VSH6548	VSM6578	VSR6731
	TurboRFP	mCMV	VSH6531	VSM6563	VSR6593
		hEF1α	VSH6533	VSM6565	VSR6728
		mEF1α	VSH6535	VSM6577	VSR6730
		PGK	VSH6549	VSM6579	VSR6732

SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA実験ワークフロー

SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA実験ワークフローは、SMARTchoice Inducible Non-targeting Control 4-Packを使用して、形質導入細胞のTurboGFP蛍光強度を評価し、目的の細胞において最もアクティブな RNAポリメラーゼIIプロモーターを特定することから始まります。次に、遺伝子特異的な SMARTvector Inducible Lentiviral shRNAおよび、それと同一のベクター構成（同じRNAポリメラーゼIIプロモーターとレポーター）を持つポジティブおよびネガティブコントロールを注文します。ドキシサイクリンの用量（濃度）および誘導時間の最適化は、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを使用して行う必要があります。目的の遺伝子を標的とするSMARTvector Inducible Lentiviral shRNAを細胞に形質導入します。その際には、厳密なデータ解釈のために、ポジティブおよびネガティブの対応するRNAiコントロールと常に同時にアッセイをすることが必要です。SMARTvector Inducible Lentiviral shRNAおよびRNAiコントロールは、即時形質導入用の高力価の精製および濃縮レンチウイルス粒子として提供されます（大腸菌グリセロールストックフォーマットも有り）。

SMARTvector Inducible Lentiviral shRNAベクターデザイン

Figure 2. Elements of the SMARTvector Inducible shRNA Lentiviral Backbone
Vector Element	Utility
5' LTR	5' Long Terminal Repeat is necessary for lentiviral particle production and integration of the construct into the host cell genome
Ψ	Psi packaging sequence allows lentiviral genome packaging using lentiviral packaging systems
RRE	Rev Response Element enhances titer by increasing packaging efficiency of full-length lentiviral genomes
TRE3G	Inducible promoter with Tetracycline Response Elements which is activated by the Tet-On 3G protein in the presence of doxycycline
tGFP or tRFP	TurboGFP or TurboRFP reporter for visual tracking of transduction and expression upon doxycycline induction
SMARTvector universal scaffold	Optimized proprietary scaffold based on native primary microRNA in which gene-targeting sequence is embedded
PuroR	Puromycin resistance gene permits antibiotic selection of transduced cells
2A	Self-cleaving peptide that enables the expression of both PuroR and Tet-On 3G transactivator from a single RNA pol II promoter
Tet-On 3G	Encodes the doxycycline-regulated transactivator protein, which binds to TRE3G only in the presence of doxycycline
WPRE	Woodchuck Hepatitis Post-transcriptional Regulatory Element enhances transgene expression in target cells
3' SIN LTR	3' Self-inactivating Long Terminal Repeat for generation of replication-incompetent lentiviral particles

SMARTvector Inducible Lentiviral shRNAプロモーター活性は細胞タイプによって異なる

図中の細胞株に、SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA Non-targetingコントロールをMOI = 0.3で形質導入しました。形質導入の24時間後、non-targeting shRNAおよびTurboGFPの発現を1 µg/mLドキシサイクリンで誘導しました。ドキシサイクリンの存在下で48時間培養した後、細胞をHoescht-33342で染色し、核（青）とTurboGFP（緑）を画像化しました。フィールド内の細胞の約30％が形質導入されていますが、特定の細胞タイプでは、恒常的プロモーター活性が低いことを示すTurboGFP発現が低いため、一部の画像には30％未満のTurboGFP陽性細胞が含まれているように見える場合があります。

SMARTvector Inducible Lentiviral shRNAは、時間およびドキシサイクリンの用量依存的に必須遺伝子の厳密に制御されたノックダウンを可能にする

horizon discovery figure

A: U2OS細胞に、non-targetingコントロールshRNA（NTC）またはユビキチンB（UBB）遺伝子に対するshRNAのいずれかを運ぶSMARTvector Inducible Lentiviral shRNAベクター（mCMVプロモーター）をMOI = 0.1で形質導入しました。1.5 µg/mLピューロマイシンで3日間細胞を選択し、選択後、細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり2000細胞で播種しました。24時間後（1日目）、指示された用量のドキシサイクリンでshRNA発現を誘導し、CellTiter-Glo®アッセイ（Promega）で細胞数を毎日測定しました。各データポイントは、6つの独立したウェルの平均と標準偏差を表します。
B: 6日目に、ドキシサイクリンへの5日間の曝露後、細胞をHoescht 33342で染色し、細胞核（青）とTurboGFP（緑）をArrayScan™ VT IHCSリーダーで画像化しました。
C:フィールドあたりの核の数として定義される細胞密度は、条件ごとに18フィールドについて計算しました。