一貫性のない結果を回避するために役立つ、適切なソリューションの選択
CRISPRテクノロジーは、標的遺伝子座に二本鎖切断を作成し、挿入または欠失（indel）を生み出します。これにより、最終的にフレームシフト変異を生じさせるものです。その後の転写の破壊は、機能喪失研究に理想的な遺伝子ノックアウト（KO）を作製します。
実験のセットアップでは、一度に多数の細胞をトランスフェクションする必要があることが多く、その結果、さまざまなindel集団を含む編集された細胞の異種のプールができます。単一細胞の分離は時間がかかり少し退屈なプロセスであり、トランスフェクション後のプールでの作業は結果への迅速な道のりのように思えるかもしれません。そのため、多くの研究者は、プールを使用して迅速な結果を取得するか、高度に特徴が明らかである安定した細胞モデルを取得するために単一細胞の選択を続けるかの選択に直面します。
クローン細胞株を用いるか、プール細胞集団を用いるかを決定する際に考慮すべき最も重要な4つの事項
- ホモ接合型ノックアウト効率
遺伝子が確実に切断されることを確実にするには、標的遺伝子のすべての対立遺伝子が編集されていることが不可欠です。タンパク質発現に影響を与えるほどの高いCRISPR切断効率でもって編集細胞のプールを作製することは可能です。しかしながら、プール細胞集団が100％ホモ接合性KOクローンで構成されない限り、未編集またはヘテロ接合性細胞から十分なタンパク質の発現するリスクがあり、一貫性のない結果を生み出す可能性があります。高度に特徴の明らかなホモ接合型のクローンモデルを使用すると、タンパク質発現が完全に除去され、実験ごとに同じ結果を再現できます。
- 遺伝子コピー数
標的遺伝子の対立遺伝子の数は、成功する成果が得られる可能性に影響します。多くの一般的に使用されるがん細胞株はゲノム全体で3つ以上のコピーを持つということは重要な考慮事項です。使用する細胞株が標的遺伝子の倍数性である場合、タンパク質発現のリスクが増加します。高度に特徴の明らかなクローン細胞株で作業すると、遺伝子のコピーが3つ以上ある場合でも、遺伝子のすべての対立遺伝子が機能的に編集されてノックアウトが作製されます。
- 遺伝子の必須性
未編集、またはヘテロ接合のクローンが、遺伝子の必須性を覆い隠す可能性があります。完全なKOクローンはバルク培養から除去されるためです。2倍体細胞のバックグラウンドで常に50％のヘテロ接合編集を取得している場合、これは遺伝子が必須であることを示唆しています。
- オルタナティブスプライシングによる遺伝子発現
もう１つの考慮事項としては、エクソンスキッピングとナンセンス関連のオルタナティブスプライシングを介した不完全な標的切断の可能性です。タンパク質のすべてのアイソフォームには存在しないエクソンにindelが導入された場合、残留タンパク質の発現と部分的な表現型機能の生じる可能性があります。保存されたエクソンの編集されたクローン細胞を作製して使用すれば、タンパク質が完全に機能喪失しているため、そのような可能性は減ります。
これらの要因が結果を妨げる程度は、関係する標的によって異なります。多くの標的では、プール細胞集団ですばやく確認することで、プロジェクトを進めるのに十分な方向性が得られます。しかし、より再現性の高い結果を安心して得るためには、クローン細胞株はすべての個々の細胞が同じ機能喪失変異を抱えているため、一貫性のある結果を提供します。
クローン細胞株を得たら、一貫性のない結果が生じた場合に元のマテリアルに戻ることができるように、クローン系統を増やし継代数の少ないクローン細胞株をバンクすることをお勧めします。細胞培養継代による遺伝的浮動または選択圧も、クローン細胞株が経時的に応答する方法に偏差を生じさせる可能性があります。
単一細胞クローン増殖中の変動によって引き起こされる潜在的な問題を防ぐには、2つのクローンで結果を確認することをお勧めします。多くの場合、選択プロセス中に複数のクローンが派生します。これらの利用により、より確実な機会が提供されます。
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