カスタムPin-pointガイドRNAのご注文は、画面右側のツールをご利用ください。また、下記のガイドラインをご確認いただくか、PDF版をダウンロードしてご参照いただけます。詳しくは、Pin-point塩基編集プラットフォーム向けガイドRNA設計に関するアプリケーションノートをダウンロードしてご覧ください。
nCas9(NGG PAM配列)およびラット由来APOBECデアミナーゼに基づく、タンパク質ノックアウト実験用sgRNA選択ガイドライン
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手動方法または公開されている塩基編集ガイドRNA設計ツール(参考:Example ResourcesセクションまたはAppendix A)を使用し、関心のある転写物に基づいて、目的のsgRNAプロトスペーサー(標的)配列の候補リストを作成してください。
- A) タンパク質ノックアウトを目的として、CAA、CAG、CGA、またはTGGコドンを終止コドンに変換可能なNGG PAMを有するsgRNAを設計し、早期終止コドンを生成します(図1)。この変換は、標的となるC塩基がスペーサー配列の5'→3'方向における3〜8番目の位置に存在する場合に可能です(図2)1。
- B) スプライス部位の破壊によるタンパク質ノックアウトの誘導
- NGG PAMを有するsgRNAの設計による、標的C塩基のスペーサー配列5'→3'方向における3〜8番目の位置への配置(図2参照)1
- 一般的なスプライスアクセプター部位:イントロン-AG|エクソン
- 一般的なスプライスドナー部位:エクソン|GT-イントロン
- GC塩基対からAT塩基対への変換によるスプライス部位の破壊2
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必要に応じたsgRNA候補リストの絞り込み
- タンパク質ノックアウトの可能性が高いsgRNAの選定に向けた遺伝子構造の考慮
- 最初および最後のエクソンを標的とするsgRNAを回避する
- タンパク質の中央領域(トランスクリプトの中間10〜60%)を標的とするsgRNAを優先する。※追加候補が必要な場合は、60%以降のCDS領域も対象に含める
- タンパク質の必須ドメイン(例:受容体の膜貫通ドメイン)をコードするエクソンを標的とするsgRNAを優先する
- 非対称エクソンの標的化を優先する。※対称エクソンを標的とした場合、エクソンがスキップされても後続エクソンがフレーム内に保持される可能性あり3
- gRNAがすべての必要なアイソフォームを標的とすることを確認する
- 標的Cの5'側2塩基に基づくsgRNAの優先順位付け3
- 配列コンテキストがNTCまたはTCCの場合を優先する
- 配列コンテキストがNGCまたはGCCの場合を回避する
図1:シチジンのデアミネーションによって生成可能な終止コドン1
図2:塩基編集ウィンドウ。濃緑:高効率編集の可能性 淡緑:低効率編集の可能性 白:バイスタンダー編集の可能性
References
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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5610906 (see figure 1)
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https://www.nature.com/articles/s41467-021-22009-2 (see figure 1)
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Poster - Performance and modularity of Horizon’s Pin-point™ base editing system characterized by arrayed and pooled screening platforms
Additional External Resources
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BE-Designer http://www.rgenome.net/be-designer/
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iSTOP https://www.ciccialab-database.com/istop/#/
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PnB Designer https://fgcz-shiny.uzh.ch/PnBDesigner/
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beditor https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6553823/ (requires the use of Python)
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SpliceR https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33893286/
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CRISPR-BETS https://zhangtaolab.org/software/crisprbets
すべてのカスタムsgRNA配列は、実験的な検証が必要です。これらのガイドラインおよび提案は、機能性を保証するものではありません。オフターゲット効果を最小限に抑えるため、sgRNA配列の特異性については常に考慮してください。
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カスタムsgRNAの注文
ガイドラインをPDFでダウンロード
Designing custom single guide RNAs (sgRNAs)
nCas9(NGG PAM配列)およびラット由来APOBECデアミナーゼに基づく、タンパク質ノックアウト実験用sgRNA選択ガイドライン
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Contact Usラット由来のAPOBECデアミナーゼは、CをTに、またはGをAに変換するために使用できます。以下に両方の例を示します。
例1:Cを標的とする場合
- 編集するヌクレオチドを特定します(オレンジ色で表示)。この例では、CAGがストップコドン(TAG)に変換されます。NGGのPAM配列は、常に標的鎖*のスペーサーの3'末端側に位置することを考慮してください。
- アクティビティウィンドウ内に配置されていることを確認します(濃い緑色ほど編集効率が高い可能性を示します)。
- スペーサー配列は非標的鎖に結合し、それに相補的である必要があります。
- 配列は5'から3'方向で、DNA配列として入力します(UではなくTを使用)。この例では、入力配列は「5'- AGTTCAGGCCTGCGAATTAA - 3'」となります。
例2:Gを標的とする場合
- 編集するヌクレオチドを特定します(オレンジ色で表示)。この例では、スプライスアクセプター部位(AG)が変異させられます。NGGのPAM配列は、常に標的鎖*のスペーサーの3'末端側に位置することを考慮してください。
- アクティビティウィンドウ内に配置されていることを確認します(濃い緑色ほど編集効率が高い可能性を示します)。
- スペーサー配列は非標的鎖に結合し、それに相補的である必要があります。
- 配列は5'から3'方向で、DNA配列として入力します(UではなくTを使用)。この例では、入力配列は「5'-TTAACTCGCTGGACTGAAGT-3'」となります。
*標的鎖 = デアミナーゼが作用するC基質が存在する鎖