カスタムsgRNAの設計・注文

Pin-point™塩基編集プラットフォーム用

カスタムPin-pointガイドRNAのご注文は、画面右側のツールをご利用ください。また、下記のガイドラインをご確認いただくか、PDF版をダウンロードしてご参照いただけます。詳しくは、Pin-point塩基編集プラットフォーム向けガイドRNA設計に関するアプリケーションノートをダウンロードしてご覧ください。
nCas9(NGG PAM配列)およびラット由来APOBECデアミナーゼに基づく、タンパク質ノックアウト実験用sgRNA選択ガイドライン
  1. 手動方法または公開されている塩基編集ガイドRNA設計ツール(参考:Example ResourcesセクションまたはAppendix A)を使用し、関心のある転写物に基づいて、目的のsgRNAプロトスペーサー(標的)配列の候補リストを作成してください。
    1. A) タンパク質ノックアウトを目的として、CAA、CAG、CGA、またはTGGコドンを終止コドンに変換可能なNGG PAMを有するsgRNAを設計し、早期終止コドンを生成します(図1)。この変換は、標的となるC塩基がスペーサー配列の5'→3'方向における3〜8番目の位置に存在する場合に可能です(図2)1
    2. B) スプライス部位の破壊によるタンパク質ノックアウトの誘導
      1. NGG PAMを有するsgRNAの設計による、標的C塩基のスペーサー配列5'→3'方向における3〜8番目の位置への配置(図2参照)1
      2. 一般的なスプライスアクセプター部位:イントロン-AG|エクソン
      3. 一般的なスプライスドナー部位:エクソン|GT-イントロン
      4. GC塩基対からAT塩基対への変換によるスプライス部位の破壊2
  2. 必要に応じたsgRNA候補リストの絞り込み
    1. タンパク質ノックアウトの可能性が高いsgRNAの選定に向けた遺伝子構造の考慮
      1. 最初および最後のエクソンを標的とするsgRNAを回避する
      2. タンパク質の中央領域(トランスクリプトの中間10〜60%)を標的とするsgRNAを優先する。※追加候補が必要な場合は、60%以降のCDS領域も対象に含める
      3. タンパク質の必須ドメイン(例:受容体の膜貫通ドメイン)をコードするエクソンを標的とするsgRNAを優先する
      4. 非対称エクソンの標的化を優先する。※対称エクソンを標的とした場合、エクソンがスキップされても後続エクソンがフレーム内に保持される可能性あり3
      5. gRNAがすべての必要なアイソフォームを標的とすることを確認する
    2. 標的Cの5'側2塩基に基づくsgRNAの優先順位付け3
      1. 配列コンテキストがNTCまたはTCCの場合を優先する
      2. 配列コンテキストがNGCまたはGCCの場合を回避する

Stop codons

図1:シチジンのデアミネーションによって生成可能な終止コドン1

 

Base editing window

図2:塩基編集ウィンドウ。濃緑:高効率編集の可能性 淡緑:低効率編集の可能性 白:バイスタンダー編集の可能性

References
  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5610906 (see figure 1)
  2. https://www.nature.com/articles/s41467-021-22009-2 (see figure 1)
  3. Poster - Performance and modularity of Horizon’s Pin-point™ base editing system characterized by arrayed and pooled screening platforms
Additional External Resources

すべてのカスタムsgRNA配列は、実験的な検証が必要です。これらのガイドラインおよび提案は、機能性を保証するものではありません。オフターゲット効果を最小限に抑えるため、sgRNA配列の特異性については常に考慮してください。

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