Design and order custom single guide RNAs (sgRNAs)

カスタムPin-pointガイドRNAのご注文は、画面右側のツールをご利用ください。また、下記のガイドラインをご確認いただくか、PDF版をダウンロードしてご参照いただけます。詳しくは、Pin-point塩基編集プラットフォーム向けガイドRNA設計に関するアプリケーションノートをダウンロードしてご覧ください。

nCas9（NGG PAM配列）およびラット由来APOBECデアミナーゼに基づく、タンパク質ノックアウト実験用sgRNA選択ガイドライン

1. 手動方法または公開されている塩基編集ガイドRNA設計ツール（参考：Example ResourcesセクションまたはAppendix A）を使用し、関心のある転写物に基づいて、目的のsgRNAプロトスペーサー（標的）配列の候補リストを作成してください。

A) タンパク質ノックアウトを目的として、CAA、CAG、CGA、またはTGGコドンを終止コドンに変換可能なNGG PAMを有するsgRNAを設計し、早期終止コドンを生成します（図1）。この変換は、標的となるC塩基がスペーサー配列の5'→3'方向における3〜8番目の位置に存在する場合に可能です（図2）¹。

B) スプライス部位の破壊によるタンパク質ノックアウトの誘導

NGG PAMを有するsgRNAの設計による、標的C塩基のスペーサー配列5'→3'方向における3〜8番目の位置への配置（図2参照）¹

一般的なスプライスアクセプター部位：イントロン-AG｜エクソン

一般的なスプライスドナー部位：エクソン｜GT-イントロン

GC塩基対からAT塩基対への変換によるスプライス部位の破壊²

2. 必要に応じたsgRNA候補リストの絞り込み

タンパク質ノックアウトの可能性が高いsgRNAの選定に向けた遺伝子構造の考慮

最初および最後のエクソンを標的とするsgRNAを回避する

タンパク質の中央領域（トランスクリプトの中間10〜60％）を標的とするsgRNAを優先する。※追加候補が必要な場合は、60％以降のCDS領域も対象に含める

タンパク質の必須ドメイン（例：受容体の膜貫通ドメイン）をコードするエクソンを標的とするsgRNAを優先する

非対称エクソンの標的化を優先する。※対称エクソンを標的とした場合、エクソンがスキップされても後続エクソンがフレーム内に保持される可能性あり3

gRNAがすべての必要なアイソフォームを標的とすることを確認する

標的Cの5'側2塩基に基づくsgRNAの優先順位付け³

配列コンテキストがNTCまたはTCCの場合を優先する

配列コンテキストがNGCまたはGCCの場合を回避する

図1：シチジンのデアミネーションによって生成可能な終止コドン¹

図2：塩基編集ウィンドウ。濃緑：高効率編集の可能性 淡緑：低効率編集の可能性 白：バイスタンダー編集の可能性

References

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5610906 (see figure 1)

2. https://www.nature.com/articles/s41467-021-22009-2 (see figure 1)

3. Poster - Performance and modularity of Horizon’s Pin-point™ base editing system characterized by arrayed and pooled screening platforms

Additional External Resources

• BE-Designer http://www.rgenome.net/be-designer/

• iSTOP https://www.ciccialab-database.com/istop/#/

• PnB Designer https://fgcz-shiny.uzh.ch/PnBDesigner/

• beditor https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6553823/ (requires the use of Python)

• SpliceR https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33893286/

• CRISPR-BETS https://zhangtaolab.org/software/crisprbets

すべてのカスタムsgRNA配列は、実験的な検証が必要です。これらのガイドラインおよび提案は、機能性を保証するものではありません。オフターゲット効果を最小限に抑えるため、sgRNA配列の特異性については常に考慮してください。

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