CRISPRmod CRISPRa lentiviral sgRNA

ヒトおよびマウスモデルの非常に効率的な遺伝子転写活性化のためのデザイン済みCRISPRa lentiviral sgRNA。高力価レンチウイルス粒子またはグリセロールストックとして利用可能です。

ゲノムワイドのヒトおよびマウスのlentiviral sgRNA試薬は、CRISPRa用に特別に設計されています。グリセロールストックまたは高力価精製レンチウイルス粒子として利用可能です。dCas9-VPR発現と組み合わせ、強力なCRISPR-Cas9テクノロジーを利用して遺伝子を転写活性化することができます。

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使いやすいレンチウイルス試薬による内在性遺伝子転写活性化

CRISPR activation（CRISPRa）システムは、1つ以上の遺伝子転写活性化因子に融合した触媒活性が不活化されたS. pyogenes由来Cas9（dCas9）を利用するもので、古典的なCRISPR-Cas9ゲノム編集システムをユニークに改変したものです。プロモーター領域または転写開始部位（TSS: transcriptional start site）の上流の遺伝子配列を標的とする、適切に設計されたガイドRNAと組み合わせて使用すると、転写活性化を促進します。

テクノロジーの概要は、CRISPRaアプリケーションのページをご確認ください。

CRISPRa lentiviral sgRNA試薬のハイライト

個別のコンストラクトおよびsets of 4フォーマットは、グリセロールストックまたは高力価精製レンチウイルス粒子として利用可能です。
Horlbeckら¹によって公開されたアルゴリズムを使用して設計されています。1つまたは複数の転写開始部位に隣接する最適化された設計が、強力なレベルの遺伝子転写活性化を実現しています。
精製／濃縮された高力価レンチウイルス粒子は、トランスフェクションが困難な細胞に直接形質導入することができます。
ピューロマイシン耐性遺伝子の共発現により、細胞集団を濃縮できます。

Lentiviral sgRNAを使用したCRISPRa遺伝子活性化実験に必要な試薬

CRISPRa dCas9-VPR²用のレンチウイルス発現プラスミド、レンチウイルス粒子またはmRNA。dCas9-VPRは、哺乳動物用にコドンを至適化したStreptococcus pyogenes由来dCas9にVPRを融合しています（SunTagテクノロジー³とも互換性があります）。
標的遺伝子に対するデザイン済みCRISPRa lentiviral sgRNA

CRISPRa lentiviral sgRNAベクターマップ

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CRISPRa lentiviral sgRNAベクターバックボーンでは、遺伝子特異的ガイドRNAはヒトU6プロモーターの制御下で発現します。ピューロマイシン耐性マーカー（PuroR）の発現はマウスCMVプロモーターから駆動され、CRISPRa sgRNAが組み込まれた細胞の迅速な選択を可能にします。プラスミドには、大腸菌での増殖と選択のためのAmpR耐性マーカーが含まれています。

異なるdCas9-VPR細胞株におけるCRISPRa lentiviral sgRNAの形質導入

Transductions with CRISPRa lentiviral sgRNA particles

CRISPRa dCas9-VPRを安定発現するように改変されたU2OS、HEK293T、MCF 10A、およびK562を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、ASCL1、EGFP、POU5F1またはTTNを標的とするCRISPRa sgRNAレンチウイルス粒子をMOI 0.3で形質導入して、ゲノム当たり1コピーのsgRNAコンストラクトを含む細胞を得ました。RT-qPCRで分析する前に、細胞を2 µg/mLピューロマイシンで4日間選択しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。

dCas9-VPRを安定発現するように改変されたU2OS細胞におけるCRISPRaのさまざまなガイドRNAとデリバリー方法を用いた比較

CRISPRa in U2OS cells stably expressing integrated dCas9-VPR

CRISPRa 化学合成crRNA:tracrRNAを使用したCRISPRa：細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して、ASCL1、EGFP、POU5F1、およびTTN遺伝子を標的とする化学合成crRNA:tracrRNA（25 nM）をトランスフェクトしました。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を計算しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。

lentiviral sgRNA形質導入によるCRISPRa：細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、ASCL1、EGFR、POU5F1、またはTTNを標的とするCRISPRa sgRNAレンチウイルス粒子をMOI 0.3で形質導入し、ゲノム当たり1コピーのsgRNAコンストラクトを含む細胞を得ました。RT-qPCRで分析する前に、細胞を2 µg/mLピューロマイシンで4日間選択しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。

lentiviral sgRNA plasmidのトランスフェクションによるCRISPRa：細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECT kbトランスフェクション試薬を使用して、ASCL1、EGFR、POU5F1またはTTNを標的とするCRISPRa sgRNAプラスミド（100ng）をトランスフェクトしました。（ピューロマイシン選択せずに）トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を計算しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。

ヒト人工多能性幹細胞におけるCRISPRa用 Edit-R lentiviral sgRNAの適用例

（A）ヒトiPSC（ThermoFisher Cat＃A18945）をフィーダーフリーおよび無血清培養条件で培養し、倒立蛍光顕微鏡で適切な形態を視覚化しました。（B）ヒトiPSCは、96ウェルシャトルソリューションP3を使用して、製造元のプロトコルに従ってヌクレオフェクトしました。ヌクレオフェクションの3日後、細胞を回収し、RT-qPCRの準備をしました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。