CRISPRmod CRISPRa lentiviral sgRNAポジティブコントロール

CRISPRa lentiviral sgRNAポジティブコントロールは、ヒトまたはマウスのTitin（TTN）またはPOU class 5 homeobox 1（POU5F1）遺伝子を特異的に活性化するように設計されています。ポジティブコントロールを実験条件の最適化のために常に使用し、すべての遺伝子転写活性化実験に含めて、試薬の細胞へのデリバリーとdCas9-VPR活性を確認することをお勧めします。

観察される転写活性化のレベルは、細胞の種類と発現のベースレベルによって異なります。TTNまたはPOU5F1のいずれかがすでに細胞内で発現している場合は、僅かしか活性化が見られないこともあります。non-targetingコントロールへの転写活性化レベルの正規化は、そのアッセイの最適なdCas9-VPR発現、トランスフェクション効率、およびタイムポイントを決定するためのベースラインを提供します。

Highlights

TTNおよびPOU5F1遺伝子を標的とする種特異的レンチウイルスsgRNA
高力価精製レンチウイルス粒子（1 x 10⁸ TU/mL以上, 50 µL）またはグリセロールストックとして利用可能
実験条件の最適化、および遺伝子転写活性化が確実に実施されたことを確認するために使用します。

dCas9-VPR安定発現細胞におけるlentiviral sgRNAによる効率的な遺伝子転写活性化

Efficient transcriptional gene activation

改変されたCRISPRadCas9-VPRを安定して発現するU2OS、HEK293T、MCF 10A、およびK562を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、POU5F1またはTTNをターゲットとするCRISPRa sgRNAレンチウイルス粒子をMOI 0.3で形質導入して、単一の統合体を含む細胞を得ました。RT-qPCRで分析する前に、2 µg/mLのピューロマイシンで4日間細胞を選択しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算さし、non-targetingコントロールに対して正規化しました。

さまざまなCRISPRaガイドRNAタイプで実施された活性化の比較

Comparable activation is achieved with different CRISPRa guide RNA types

化学合成crRNA:tracrRNAを使用したCRISPRa：細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して、ASCL1、EGFP、POU5F1、およびTTN遺伝子を標的とする化学合成crRNA:tracrRNA（25 nM）をトランスフェクトしました。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を計算しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。

レンチウイルスsgRNA形質導入によるCRISPRa：細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、ASCL1、EGFR、POU5F1、またはTTNを標的とするCRISPRa sgRNAレンチウイルス粒子をMOI 0.3で形質導入し、ゲノム当たり1コピーのsgRNAコンストラクトを含む細胞を得ました。RT-qPCRで分析する前に、細胞を2 µg/mLピューロマイシンで4日間選択しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。

lentiviral sgRNA plasmidのトランスフェクションによるCRISPRa：細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECT kbトランスフェクション試薬を使用して、ASCL1、EGFR、POU5F1またはTTNを標的とするCRISPRa sgRNAプラスミド（100ng）をトランスフェクトしました。（ピューロマイシン選択せずに）トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を計算しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。