- CRISPRa (CRISPR activation) 試薬
- CRISPRa lentiviral dCas9-VPR試薬
CRISPRmod CRISPRa lentiviral dCas9-VPR試薬
ご研究に最適な幅広い細胞タイプで強力な遺伝子活転写性化を実現
安定したdCas9-VPRヌクレアーゼ発現細胞集団を作製できる精製レンチウイルス粒子またはプラスミドDNAです。
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CRISPRa dCas9-VPRレンチウイルス粒子は、3つの転写活性化因子(VP64、p65、およびRta)と2つの核局在化シグナル(NLS)に融合した、ヒト用にコドンを至適化したヌクレアーゼ不活性化Cas9遺伝子を発現します。プロモーター領域または転写開始部位(TSS: transcriptional start site)の上流の遺伝子配列を標的とする適切に設計されたガイドRNAと組み合わせると、遺伝子のネイティブ転写開始部位(TSS: transcriptional start site)が活性化されます。
テクノロジーの概要は、CRISPRaアプリケーションのページをご確認ください。
ハイライト
- 独自のCRISPRa readyのdCas9-VPR安定発現細胞株を作製します。
- 即時形質導入用の濃縮精製レンチウイルス粒子です(qPCR力価測定により、1x107 TU/mL以上の機能力価)。
- パッケージング細胞株への直接トランスフェクション、および独自のレンチウイルス粒子の生産のために、認定されたエンドトキシンフリーのプラスミドDNAとしても利用可能です。
- ブラストサイジン耐性遺伝子は、細胞集団の選択、または各細胞からのクローン化を可能にします。
- 目的の細胞での最適な発現のために、3種類のプロモーターから選択できます(以下のオプションを参照)。
dCas9-VPRレンチウイルス粒子を使用したCRISPRa実験の要件
- CRISPRa dCas9-VPR lentiviral particle
- 標的遺伝子のCRISPRa lentiviral sgRNA(ワークフロータブを参照)
すべてのRNA pol IIプロモーターが異なる細胞環境で等しく活性であるわけではない
dCas9-VPRの転写を制御する任意のプロモーターの活性は、生物学的状況によって大きく異なる可能性があり、その結果、dCas9-VPRの発現レベルが変動し、ひいては遺伝子転写活性化のレベルが変動します。細胞株に最適なプロモーターを選択することは、強力な遺伝子過剰発現にとって重要です。
dCas9-VPRヌクレアーゼを発現させるためのSMARTchoiceプロモーターオプションPromoter | Description |
---|---|
hCMV | human cytomegalovirus immediate early promoter |
mCMV | mouse cytomegalovirus immediate early promoter |
hEF1α | human elongation factor 1 alpha promoter |
dCas9-VPR安定発現細胞を用いたCRISPRaワークフロー
lentiviral dCas9-VPRと化学合成crRNA:tracrRNA(左)、またはlentiviral expressed sgRNA(右)を使用したCRISPR activationワークフロー
CRISPRa plasmidコトランスフェクションワークフロー
lentiviral dCas9-VPRと発現sgRNAのプラスミドの同時トランスフェクションのためのCRISPRaワークフロー
CRISPRaによる転写活性化倍率は内在性遺伝子発現レベルに依存する
基礎発現が低いかまったくない遺伝子は、強力なレベルまで活性化するのが簡単ですが、すでに高レベルで発現している遺伝子は、さらに過剰発現するのがより困難です。dCas9-VPR安定発現U2OS細胞を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して、異なる基礎発現レベルの23種類の遺伝子を標的とするCRISPRa 化学合成crRNA:tracrRNAプール(25 nM)をトランスフェクトしました。トランスフェクションから72時間後に細胞を回収し、相対的な遺伝子発現を、RT-qPCRを使用して測定しました。CRISPRaを介した転写活性化の倍数は上のグラフに示しました。ここでは、NTCコントロールで処理されたサンプルにおける基本的な転写産物の発現レベルが低いものから高いものへと遺伝子が並べられています。下のグラフには、GAPDHコントロールと比較した標的遺伝子の基礎発現を示しています。
CRISPRa遺伝子の活性化は24時間で観察され、48〜72時間でピークになる
dCas9-VPR安定発現U2OS細胞を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、EGFR、IL1R2、POU5F1、またはTFAP2Cを標的としたCRISPRa化学合成crRNA:tracrRNAを、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトしました。4種類のCRISPRaデザイン済みCRISPRa crRNAは、個別、またはプールフォーマットで使用しました(合計濃度:25 nM)。トランスフェクションの24、48、72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を計算しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。
Certificate of analysis
Protocols
Quick protocols
Safety data sheets
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