- CRISPRa(CRISPR activation)試薬
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CRISPRmod CRISPRa lentiviral sgRNA non-targetingコントロール
ヒトまたはマウスのゲノム内の遺伝子を標的としないように生物情報学的に設計および検証されたレンチウイルスsgRNAコンストラクト

CRISPRa lentiviral sgRNA non-targetingコントロールは、ヒトおよびマウス細胞におけるCRISPRa lentiviral sgRNAを使用した遺伝子転写活性化実験のネガティブコントロールとして推奨されています。これらは、ヒト、マウス、およびラットのゲノム内のすべての潜在的なPAM隣接ターゲットに対して少なくとも3つのミスマッチまたはギャップを持つように設計されています。 これらのコントロールを使用する場合、細胞生存率または遺伝子発現の変化は、標的特異的試薬で処理された細胞と比較するためのベースラインとして使用できる非特異的細胞応答を反映している可能性があります。
Highlights
- CRISPRa guide RNA non-targeting control配列は、標的遺伝子に対して設計されたCRISPRa lentiviral sgRNAと同じレンチウイルスベクターにクローン化されています。
- ヒト、マウス、またはラットのゲノム内の潜在的なターゲット配列に対して少なくとも3つのミスマッチまたはギャップを検証するために使用される独自のアラインメントツールを採用
- 高力価精製レンチウイルス粒子またはグリセロールストックとして利用可能
安定発現dCas9-VPR細胞株を使用したCRISPRaワークフロー

Lentiviral dCas9-VPRと化学合成crRNA:racrRNA(左側)または lentiviral expressed sgRNA(右側)を使用したCRISPR activationワークフロー
CRISPRa plasmidコトランスフェクションワークフロー
dCas9-VPRとsgRNA のそれぞれレンチウイルス発現プラスミドをコトランスフェクションするCRISPRaワークフロー
異なるdCas9-VPR細胞株におけるlentiviral sgRNAの形質導入

CRISPRa dCas9-VPRを安定発現するように改変されたU2OS、HEK293T、MCF 10A、およびK562を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、ASCL1、EGFP、POU5F1またはTTNを標的とするCRISPRa sgRNAレンチウイルス粒子をMOI 0.3で形質導入して、ゲノム当たり1コピーのsgRNAコンストラクトを含む細胞を得ました。RT-qPCRで分析する前に、細胞を2 µg/mLピューロマイシンで4日間選択しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。
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