Lentiviral Cas9ヌクレアーゼ試薬フォーマットのゲノム編集ワークフロー

Lentiviral Cas9ヌクレアーゼとEdit-R Lentiviral sgRNAを使用した遺伝子ノックアウトのワークフロー

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レンチウイルスsgRNA

ゲノム編集は、プール細胞を用いたアプローチ（左側）で、通常は遺伝子ノックアウトスクリーニングが行われます。または、より明確な細胞タイプを調べたい場合は、クローン化細胞株を用いたアプローチ（右側）で表現型分析を実行します。

Edit-R Lentiviral sgRNAを使用した誘導型Lentiviral Cas9ヌクレアーゼを使用した遺伝子ノックアウトのワークフロー

Lentiviral Cas9ヌクレアーゼとEdit-R 化学合成ガイドRNAを使用した遺伝子ノックアウトワークフロー

プール化Lentiviral sgRNAライブラリーを用いたスクリーニングにおける、誘導性Lentiviral Cas9ヌクレアーゼを使用した遺伝子ノックアウトワークフロー

Lentiviral蛍光Cas9ヌクレアーゼデータ

蛍光Lentiviral Cas9ヌクレアーゼにより、高発現細胞の濃縮とCRISPR-Cas9遺伝子編集効率の向上が可能

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蛍光Lentiviral Cas9ヌクレアーゼにより、高発現細胞の濃縮とCRISPR-Cas9遺伝子編集効率の向上が可能

U2OS 細胞に、Edit-R Lentiviral hCMV mKate2-Cas9ヌクレアーゼ粒子（カタログ番号：VCAS11869)）を低感染多重度（MOI = 0.3）で形質導入し、形質導入された細胞にCas9が1つだけ組み込まれるようにしました。細胞をFACS解析のために増殖し、細胞集団をmKate2蛍光negative、low、medium、highに分けソーティングしました。これらの亜集団を増殖し、96ウェルプレートに10,000細胞／ウェルで播種しました。1日後、tracrRNA（25 nM、カタログ番号：U-002005-xx）、および Edit-R PPIB Synthetic crRNA Control（カタログ番号：U-007501-xx）または Edit-R MYC Predesign crRNA（カタログ番号：CM- 003282-01）DharmaFECT 1トランスフェクション試薬（0.3 µL/ウェル、カタログ番号：T-2001-01）を使用してトランスフェクトしました。 72時間後、In Cell Analyzer 2200（GE Healthcare; A）を使用して細胞をmKate2蛍光を画像化し、DNAミスマッチ検出アッセイのために収集して、ゲノム編集を評価しました (B)。mKate2の高発現は、PPIBおよびMYCを標的とするcrRNAのより高いゲノム編集効率と関連づけられると思われます。

Lentiviral誘導性Cas9ヌクレアーゼデータ

ドキシサイクリンで 7 日間誘導した後の誘導性 Cas9 ベクターのゲノム編集活性

構成型（CAG-Cas9）または誘導型（TRE3G-Cas9）Cas9発現レンチウイルス粒子を MOI = 0.3で細胞に形質導入し、10 µg/mLのブラスチシジンを使用してテトラサイクリンを含まない培地で10日間選択しました。次に、Cas9安定細胞にDNMT3BまたPPIB-sgRNA レンチウイルス粒子をMOI = 0.3で形質導入しました。テトラサイクリンを含まない培地で、細胞を 2 μg/mLピューロマイシンで2日間選択培養し、2つの集団（DOX-：非誘導、DOX+：誘導）に分割してドキシサイクリンでさらに 7 日間培養しました。次に細胞を溶解し、T7EIを用いたDNAミスマッチ検出アッセイを用いてIndelについて分析しました。

誘導型Cas9ヌクレアーゼベクターは、ドキシサイクリン誘導なしで21日後に最小限のリークを示す

構成型（CAG-Cas9）または誘導型（TRE3G-Cas9）Cas9発現レンチウイルス粒子を MOI = 0.3で細胞に形質導入し、10 µg/mLのブラスチシジンを使用してテトラサイクリンを含まない培地で10日間選択しました。次に、Cas9安定細胞にDNMT3または PPIB-sgRNAレンチウイルス粒子をMOI = 0.3で形質導入しました。細胞を2 µg/mLピューロマイシンで選択し、テトラサイクリンを含まない培地で21日間維持しました。次に細胞を溶解し、T7EIを用いたDNAミスマッチ検出アッセイを用いてIndelについて分析しました。

誘導型U2OS-Cas9細胞におけるドキシサイクリンの用量反応

細胞に誘導型（TRE3G-Cas9）Cas9発現レンチウイルス粒子をMOI = 0.3で形質導入し、テトラサイクリンを含まない培地中で10 µg/mLのブラストサイジンを使用して 10日間選択しました。次に、Cas9安定細胞にMOI = 0.3でPPIB-sgRNAレンチウイルス粒子を形質導入しました。細胞を2 µg/mLのピューロマイシン・テトラサイクリン不含培地で4日間選択し、トリプシンで懸濁し、様々な濃度のドキシサイクリン（0～1000 ng/mL）含有の培地の96ウェルプレートに播種しました。細胞を 72時間インキュベートし、溶解し、T7EIによるDNAミスマッチ検出アッセイを使用してIndel形成について分析しました。
上のパネル：PPIBターゲットアンプリコンのT7EIを使用したDNAミスマッチ検出アッセイの代表的なゲル画像
下のパネル：3つの独立して処理されたウェルからの遺伝子編集の推定パーセンテージの平均±SD

レンチウイルス Cas9 ヌクレアーゼデータ

異なるプロモーターによる Cas9 の発現差により、さまざまなレベルのゲノム編集が誘導される

（A）ヒト組換えU2OSユビキチン-EGFPプロテアソーム細胞株（Ubi[G76V]-EGFP）と（B）マウス線維芽細胞（NIH/3T3）に、図示のプロモーターで駆動するCas9とブラストサイジン耐性遺伝子を含むレンチウイルス粒子を安定的に形質導入しました。安定して組み込まれたCas9-blastRを有する細胞集団は、トランスフェクションの前に最低10日間ブラストサイジンで選択されました。DharmaFECT 1およびDharmaFECT 3トランスフェクション試薬をそれぞれ使用して、ヒトPPIB/マウスPpibを標的とする50 nM化学合成crRNA:tracrRNAを細胞にトランスフェクトしました。72 時間後、遺伝子編集の相対頻度は、トランスフェクトされた細胞から抽出されたゲノムDNAでT7EIを使用するDNAミスマッチ検出アッセイに基づいて計算しました。

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