lentiviral Cas9ヌクレアーゼ試薬フォーマットのゲノム編集ワークフロー

lentiviral Cas9ヌクレアーゼとEdit-R Lentiviral sgRNAを使用した遺伝子ノックアウトのワークフロー

lentiviral Cas9ヌクレアーゼとsgRNAによる遺伝子ノックアウトワークフロー。ゲノム編集は、一般的に遺伝子ノックアウトスクリーニングのために混合細胞集団アプローチ（左側）、または表現型解析のためにより明確な細胞型が必要な場合には単離クローン細胞株アプローチ（右側）を用いて行うことができます。

誘導型lentiviral Cas9ヌクレアーゼとEdit-R Lentiviral sgRNAを使用した遺伝子ノックアウトのワークフロー

lentiviral Cas9ヌクレアーゼとEdit-R化学合成ガイドRNAを使用した遺伝子ノックアウトワークフロー

プール化lentiviral sgRNAライブラリーを用いたスクリーニングにおける、誘導型lentiviral Cas9ヌクレアーゼを使用した遺伝子ノックアウトワークフロー

lentiviral蛍光Cas9ヌクレアーゼデータ

蛍光lentiviral Cas9ヌクレアーゼは、高発現細胞の濃縮とCRISPR-Cas9ゲノム編集効率の向上を可能にする

U2OS 細胞に、Edit-R lentiviral hCMV mKate2-Cas9ヌクレアーゼ粒子（カタログ番号：VCAS11869)）を低感染多重度（MOI 0.3）で形質導入し、形質導入された細胞にCas9が1つだけ組み込まれるようにしました。細胞を増殖させ、その後FACSにより細胞集団をmKate2蛍光negative、low、medium、highに分けてソーティングしました。これらの亜集団を増殖し、96ウェルプレートに10,000細胞／ウェルで播種しました。1日後、DharmaFECT 1トランスフェクション試薬（0.3 µL/ウェル、カタログ番号：T-2001-01）を用いて、tracrRNA（25 nM、カタログ番号：U-002005-xx）、および Edit-R PPIB Synthetic crRNA Control（カタログ番号：U-007501-xx）または Edit-R MYC Predesign crRNA（カタログ番号：CM- 003282-01）を、細胞にトランスフェクトしました。 72時間後、In Cell Analyzer 2200（GE Healthcare; A）を使用して、細胞のmKate2の蛍光を画像化し、DNAミスマッチ検出アッセイのために収集して、ゲノム編集を評価しました (B)。mKate2の高発現は、PPIBおよびMYCを標的とするcrRNAのゲノム編集効率の高さと関連している可能性を示唆しています。

lentiviral誘導性Cas9ヌクレアーゼデータ

ドキシサイクリンで 7 日間誘導した後の誘導性 Cas9 ベクターのゲノム編集活性

構成型（CAG-Cas9）または誘導型（TRE3G-Cas9）Cas9発現レンチウイルス粒子を MOI 0.3で細胞に形質導入し、10 µg/mLのブラストサイジンを使用してテトラサイクリンを含まない培地で10日間選択しました。次に、Cas9安定細胞にDNMT3BまたPPIB-sgRNAレンチウイルス粒子をMOI 0.3で形質導入しました。テトラサイクリンを含まない培地で、細胞を2 µg /mLのピューロマイシンで2日間選択培養し、2つの集団（DOX-：非誘導、DOX+：誘導）に分割してドキシサイクリンでさらに 7 日間培養しました。細胞を溶解し、T7EIを用いたDNAミスマッチ検出アッセイを用いてIndelについて分析しました。

誘導型Cas9ヌクレアーゼベクターは、ドキシサイクリン誘導なしで21日後に最小限のリークを示す

構成型（CAG-Cas9）または誘導型（TRE3G-Cas9）Cas9発現レンチウイルス粒子を MOI 0.3で細胞に形質導入し、10 µg/mLのブラストサイジンを使用してテトラサイクリンを含まない培地で10日間選択しました。次に、Cas9安定細胞にDNMT3または PPIB-sgRNAレンチウイルス粒子をMOI 0.3で形質導入しました。テトラサイクリンを含まない培地で細胞を2 µg/mLピューロマイシンで選択し、21日間維持しました。細胞を溶解し、T7EIを用いたDNAミスマッチ検出アッセイを用いてIndelについて分析しました。

誘導型U2OS-Cas9細胞におけるドキシサイクリンの用量反応

細胞に誘導型（TRE3G-Cas9）Cas9発現レンチウイルス粒子をMOI 0.3で形質導入し、テトラサイクリンを含まない培地中で10 µg/mLのブラストサイジンを使用して 10日間選択しました。次に、Cas9安定細胞にMOI 0.3でPPIB-sgRNAレンチウイルス粒子を形質導入しました。細胞を2 µg/mLのピューロマイシン・テトラサイクリンを含まない培地で4日間選択し、トリプシンで懸濁し、96ウェルプレートに様々な濃度のドキシサイクリン（0～1000 ng/mL）を含有した培地に播種しました。細胞を 72時間インキュベートした後、溶解し、T7EIによるDNAミスマッチ検出アッセイを用いてIndel形成について分析しました。
上段：PPIBターゲットアンプリコンのT7EIを使用したDNAミスマッチ検出アッセイの代表的なゲル画像
下段：独立に処理された3つのウェルからのゲノム編集の推定パーセンテージの平均±SD

lentiviral Cas9ヌクレアーゼ試薬データ

異なるプロモーターによる Cas9 の発現差により、さまざまなレベルのゲノム編集が誘導される

（A）ヒト組換えU2OSユビキチン-EGFPプロテアソーム細胞株（Ubi[G76V]-EGFP）と（B）マウス線維芽細胞（NIH/3T3）に、図示のプロモーターで駆動するCas9とブラストサイジン耐性遺伝子を含むレンチウイルス粒子を安定的に形質導入しました。Cas9-blastRが安定に組み込まれた細胞集団は、トランスフェクションの前に10日間以上ブラストサイジンで選択しました。DharmaFECT 1およびDharmaFECT 3トランスフェクション試薬をそれぞれ使用して、ヒトPPIB/マウスPpibを標的とする50 nM化学合成crRNA:tracrRNAを細胞にトランスフェクトしました。72 時間後、ゲノム編集の相対頻度は、トランスフェクトされた細胞から抽出されたゲノムDNAでT7EIを使用するDNAミスマッチ検出アッセイに基づいて計算しました。

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