Edit-R デザイン済みガイドRNA保証

すべてのデザイン済みEdit-RガイドRNAは、Edit-Rテクニカルマニュアルに記載されているとおりに細胞導入した場合に、ターゲット領域で編集（DNA切断）できることを保証します。

Edit-RガイドRNA保証は、野生型S. pyogenes由来Cas9ヌクレアーゼ（タンパク質、mRNA、発現用プラスミド、または発現用レンチウイルスベクター）とともに使用した場合に適用されます。更にEdit-R 化学合成crRNAは、Edit-R tracrRNAとともに使用した場合に適用されます。

T7EIまたはSurveyorミスマッチ検出アッセイを使用して、試薬で処理された細胞集団の編集の分析結果を提示する必要があります。同時並行で適切に実施されたEdit-R ポジティブコントロールが成功する一方で、Edit-Rデザイン済みガイドRNAによる編集が成功しない場合、同じフォーマットで同じ容量の、異なるEdit-Rデザイン済みガイドRNAの交換製品が、1回限り無償で提供されます。

交換製品の提供は、テクニカルサポートチームとの話し合いでのみ承認されます。

DNAレベルでの編集（切断）の成功は、常に機能的な遺伝子ノックアウトにつながるとは限りません。複数のガイドRNAをテストして、標的遺伝子のノックアウトに最も効果的なガイドRNAを決定することをお勧めします。

この保証は付随する実験費用には適用されず、CRISPR Design Toolを介して注文されたガイドRNAには適用されず、また本保証により交換したガイドRNAには適用されません。

Cas9発現用プラスミドと化学合成crRNA:tracrRNAを用いた遺伝子ノックアウトワークフロー

 

---

 

Cas9発現用レンチウイルス粒子と化学合成crRNA:tracrRNAを用いた遺伝子ノックアウトワークフロー

Edit-R 化学合成crRNAコントロール

• ポジティブコントロールと検出プライマー

  特徴のはっきりした遺伝子を標的とする種特異的な化学合成crRNAおよびミスマッチ検出アッセイプライマーを使用して、ゲノム編集効率を最大化する実験条件を検討します。

• Non-targetingコントロール

  標的遺伝子特異的crRNAの非存在下でCRISPR-Cas9コンポーネントに対するベースラインの細胞応答を評価するためのnon-targetingコントロールです。

サポートデータ

crRNAおよびtracrRNA必要量

この表は、推奨されるcrRNA:tracrRNA作業濃度（25 nM:25nM）を用いて、さまざまなプレート／ウェル形式でリピッドトランスフェクション法を実施できる概算の実験数を示しています。計算では、ピペッティングエラーは考慮されていません。

crRNA nmol	tracrRNA nmol	96-well plate 100 µL reaction volume	24-well plate 500 µL reaction volume	12-well plate 1000 µL reaction volume	6-well plate 2500 µL reaction volume
2	2	800	160	80	32
5	5	2000	400	200	80
10	10	4000	800	400	160
20	20	8000	1600	800	320

---

 

化学合成crRNA編集効率

組換えU2OS細胞株で安定的に発現したCas9、およびEdit-R 化学合成crRNA:tracrRNAを用いた細胞ベースのアッセイで観察されたVCPタンパク質の機能的ノックアウト

組換えU2OSユビキチン-EGFPプロテアソーム細胞株（Ubi [G76V] -EGFP）に、特定の（図に示した）プロモーターの制御下でCas9を発現するレンチウイルス粒子を形質導入しました。Cas9が安定して組み込まれた細胞集団を、トランスフェクションの最低10日前からブラストサイジン処理で選択しました。DharmaFECT 3 Transfection Reagentを使用して、プロテアソーム機能に必要な遺伝子であるVCPを標的とするEdit-R 化学合成 crRNA:tracrRNA複合体を細胞に50 nMにてトランスフェクトしました。72時間後、トランスフェクトされた細胞のEGFP +細胞を調べ（上パネル）、T7エンドヌクレアーゼIを用いたDNAミスマッチ検出アッセイに基づいて、ゲノム編集の相対頻度を計算しました（下パネル）。

---

 

化学合成sgRNAおよびcrRNA:tracrRNAのノックアウトパフォーマンス

CAGプロモーター制御下でCas9を安定的に発現するU2OSユビキチン-EGFP細胞株に、プロテアソーム成分PSMD7（A）またはPSMD11（B）を標的とするガイドRNA（crRNA:tracrRNAまたはsgRNA）の濃度を変えてトランスフェクトしました。トランスフェクトされた細胞は、EGFPの蓄積／強度により機能的遺伝子ノックアウトについて評価しました。

---

 

化学合成crRNA:tracrRNAは、すべてのCas9 Nucleaseフォーマットと互換性がある

U2OS細胞をトランスフェクションの1日前に10,000細胞／ウェルで播種しました。DharmaFECT Duoトランスフェクション試薬（0.4 uL/ウェル）を使用して、Edit-R Cas9 Nucleaseプラスミド（200 ng）、Edit-R Cas9 Nuclease mRNA（200 ng）またはCas9ヌクレアーゼタンパク質（25 nM）のいずれかを、PPIBをターゲットとするcrRNA:tracrRNA（25 nM）と共にトランスフェクトしました（生物学的トリプリケート）。

---

 

Edit-R crRNA:tracrRNAのトランスフェクションによるCas9発現NIH/3T3細胞株での効率的なゲノム編集

NIH/3T3細胞に、特定の（図に示した）プロモーターによって駆動されるCas9およびブラストサイジン耐性遺伝子を含むレンチウイルス粒子で安定的に形質導入しました。トランスフェクションの10日前からブラストサイジン選抜を行い、Cas9の安定的に導入された細胞集団を選択しました。DharmaFECT 1トランスフェクション試薬を使用して、PPIBをターゲットとする50 nM Edit-R 化学合成crRNA:tracrRNAを細胞にトランスフェクトしました。72時間後、T7エンドヌクレアーゼIを用いたDNAミスマッチ検出アッセイに基づいて、遺伝子編集の相対頻度を計算しました。

---

 

デザインアルゴリズムのパフォーマンス

Edit-Rアルゴリズムのスコアが高いcrRNAは、スコアの低いデザインよりも切断効率が高い

10個の遺伝子について、機能スコアが高い10個のcrRNA（青いバー）と、同じ遺伝子について、機能スコアが低い10個のcrRNA（黄緑色のバー）を、次世代シーケンサーによってゲノム編集効率を見るためにテストしました。高スコアのcrRNAの93％について40％以上の編集（挿入または欠失）が確認できました。一方、低スコアのcrRNAの32％について40％以上の編集（挿入または欠失）が確認できました。0.25 µL/ウェルのDharmaFECT 1を使用して、Cas9-HEK293T細胞株に50 nM crRNA:tracrRNAをトランスフェクトしました。トランスフェクションの72時間後、細胞を溶解し、各crRNA部位にまたがるNexteraトランスポゾン適合アンプリコンを、処理したサンプルごとに生成しました。トランスフェクトされていないサンプルからのマッチしたコントロールアンプリコンも同時に生成しました。Nextera 96-well index kitを使用してサンプルのインデックスを作成し、MiSeqでのシーケンス用にプールしました。NGS品質フィルタリング基準に合格したリードは、参照ファイル（Bowtie2 v2.1.0）に配列されました。完全なリードの割合が計算され、対照であるトランスフェクトされていないサンプル（Samtools v0.1.12a）に対して正規化されました。 データは編集された割合を正規化して表示しています。

---

 

Edit-Rアルゴリズムにおいて機能スコアが高いcrRNAのデザインは、低スコアよりもApoONEアッセイでより強い表現型を示す

 

CAGプロモーターの下流にCas9が組み込まれたU2OS-プロテアソーム細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり10,000細胞で播種しました。プレーティングの24時間後、0.2 µg/ウェルのDharmaFECT 4を使用して、細胞に25 nM crRNA:tracrRNAをトランスフェクトしました。 ApoONEホモジニアスアッセイ（Promega）を使用して、トランスフェクションの48時間後にアポトーシスについて細胞を分析しました。ApoONEアッセイでBCL2L1、PLK1、またはWEE1をターゲットとするcrRNAの機能をボックスプロットで表しています。crRNAを機能スコアに基づいて下半分（H1）と上半分（H2）に分割して、ボックスプロットを作成しました。中央値、下位四分位と上位四分位間のデータの分布、および最小値と最大値は、スコアの高いcrRNAは機能が向上していることを示しています。

---

 

ギャップとミスマッチのあるデザインは、オフターゲット切断を引き起こす可能性がある

目的の標的部位を持つcrRNA（GGTCATCTGGGAGAAAAGCG）と、1つのギャップと1つのミスマッチを含みオフターゲットなcrRNA（GGT-ATCTGGGAGAAAAGCA）のT7EIミスマッチ分析です。オフターゲットなcrRNAについて、Edit-Rアライメントツールではギャップとミスマッチが特定されましたが、他のオンラインツールでは特定されませんでした。一般的に使用されるWebベースのcrRNA特異性ツールの多くは、アライメントを実行する際のギャップを完全には考慮していません。

---

 

crRNA修飾デザイン

2x MS修飾または非修飾crRNA:tracrRNAによる遺伝子編集の効率

A.ヌクレアーゼによる分解をブロックするための化学修飾は、Cas9 mRNAとcrRNA:tracrRNAの同時エレクトロポレーションを成功させるために必要です。
B. Cas9タンパク質とcrRNA:tracrRNAの同時エレクトロポレーションでは、安定化修飾は必要ありませんが、追加することで結果が改善される場合があります。

---

 

Edit-R 化学合成ガイドRNAは、in vitroで転写されたガイドRNAと比較して、本質的に自然免疫応答や毒性を引き起こさない

HEK293T Cas9ヌクレアーゼ発現細胞株に、PPIBおよびDNMT3B遺伝子を標的とする異なる化学合成ガイドRNAフォーマット（非修飾crRNA:tracrRNA、5’crRNAと3’ tracrRNAを2xMSで修飾したcrRNA:tracrRNA、crRNAとtracrRNA ともに5’および3’を3xMSで修飾したcrRNA:tracrRNA、そして非修飾化学合成sgRNA、5’および3’を2xMSまたは3xMSで修飾した化学合成sgRNA、およびin vitro転写sgRNA）をトランスフェクションしました。72時間後に、レサズリン還元アッセイ（赤い点）で生存率を評価し、5つの免疫応答遺伝子のレベルをRT-qPCRによって定量化しました。

*MS: 2’-O-メチルヌクレオチドとホスホロチオエート骨格結合

---

 

Edit-R 化学合成crRNAおよびtracrRNAのヌクレアーゼ耐性を改善するための修飾の位置と構造

A. Edit-R 化学合成crRNAおよびtracrRNAでのヌクレアーゼ耐性の修飾の位置。 Edit-R 化学合成ガイドRNAは、crRNA（緑色鎖）の5’末端の2つのヌクレオチドとtracrRNA（青い鎖）の3’末端の2つのヌクレオチドに2ʹ-O-methyl (2ʹ-OMe)および骨格ホスホロチオエート結合（PS）を含みます。
B. 2ʹ-OMeおよびPS骨格のホスホロチオエート結合の構造

---

 

Additional References

1. R. Barrangou, A. Birmingham, et. al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research, 43(7) 3407-3419 (2015)
2. M.L. Kelley, Ž. Strezoska, et al. Versatility of chemically synthesized guide RNAs for CRISPR-Cas9 genome editing. J. Biotechnol. 233, 74–83 (2016). doi:10.1016/j.jbiotec.2016.06.011
3. G. Sivan, P. Ormanoglu, et al. Identification of Restriction Factors by Human Genome-Wide RNA Interference Screening of Viral Host Range Mutants Exemplified by Discovery of SAMD9 and WDR6 as Inhibitors of the Vaccinia Virus K1L-C7L- Mutant. mBio. B(4), e01122 (2015). doi: 10.1128/mBio.01122-15 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4526713/

Edit-R crRNA:tracrRNA to generate knockout cells lines for RNAi hit validation

1. D. Wulan, S. Xinghua, et al. CASFISH: CRISPR/Cas9-mediated in situ labeling of genomic loci in fixed cells. PNAS. 112(38), 11870–11875 (2015). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26324940

Custom designed Edit-R crRNA

1. J. McCaffrey, J. Sibert, et al. CRISPR-CAS9 D10A nickase target-specific fluorescent labeling of double strand DNA for whole genome mapping and structural variation analysis. Nucleic Acids Res. 44(2), e11 (2016). doi: 10.1093/nar/gkv878 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26481349

CRISPR-Cas9 D10A nickase used with Edit-R crRNA:tracrRNA

1. S. Opp, D.A.S.A. Vieira, et al. MxB Is Not Responsible for the Blocking of HIV-1 Infection Observed in Alpha Interferon-Treated Cells. J. Virol. 90, 3056-3064 (2015). doi:10.1128/JVI.03146-15 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26719253

MxB knockout (KO) cell lines were generated by using Edit-R Cas9 Nuclease expression plasmid and crRNA:tracrRNA

1. J. Tan, Martin, SE (2016) Validation of Synthetic CRISPR Reagents as a Tool for Arrayed Functional Genomic Screening. PLoS ONE 11(12): e0168968. doi:10.1371/journal.pone.0168968

Arrayed crRNA library screening (Edit-R Ubiquitin Enzymes library)

1. H. Ogiwara, M. Sasaki, et al. Targeting p300 addiction in CBP-deficient cancers causes synthetic lethality by apoptotic cell death due to abrogation of MYC expression. Cancer Discov. 2016 Apr;6(4):430-45. doi: 10.1158/2159-8290.CD-15-0754. Epub 2015 Nov 24 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26603525

HEK293T CBP-KO cells (#2-4) bearing a 1 bp insertion in exon 9 of CBP were constructed using Edit-R Cas9 Nuclease expression plasmid and crRNA:tracrRNA

1. A. Paix, H. Schmidt, et al. Cas9-assisted recombineering in C. elegans: genome editing using in vivo assembly of linear DNAs. Nucleic Acids Res. (2016). doi:10.1093/nar/gkw502 2015
2. M.L. Kelley, Ž. Strezoska, et al. Versatility of chemically synthesized guide RNAs for CRISPR-Cas9 genome editing. J. Biotechnol. 233, 74–83 (2016). doi:10.1016/j.jbiotec.2016.06.011
3. J.F. Hultquist, K. Schumann, et al. A Cas9 Ribonucleoprotein Platform for Functional Genetic Studies of HIV-Host Interactions in Primary Human T Cells. Cell Reports. 17, 1438–1452 (2016). dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2016.09.080
4. K. He, E. Chou, et al. Conjugation and evaluation of triazole-linked single guide RNA for CRISPR-Cas9 gene editing. ChemBioChem. 17, 1809–1812 (2016).doi:10.1002/cbic.201600320

1. R. Barrangou, A. Birmingham, et. al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research, 43(7) 3407-3419 (2015)
2. M.L. Kelley, Ž. Strezoska, et al. Versatility of chemically synthesized guide RNAs for CRISPR-Cas9 genome editing. J. Biotechnol. 233, 74–83 (2016). doi:10.1016/j.jbiotec.2016.06.011
3. G. Sivan, P. Ormanoglu, et al. Identification of Restriction Factors by Human Genome-Wide RNA Interference Screening of Viral Host Range Mutants Exemplified by Discovery of SAMD9 and WDR6 as Inhibitors of the Vaccinia Virus K1L-C7L- Mutant. mBio. B(4), e01122 (2015). doi: 10.1128/mBio.01122-15 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4526713/

Edit-R crRNA:tracrRNA to generate knockout cells lines for RNAi hit validation

1. D. Wulan, S. Xinghua, et al. CASFISH: CRISPR/Cas9-mediated in situ labeling of genomic loci in fixed cells. PNAS. 112(38), 11870–11875 (2015). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26324940

Custom designed Edit-R crRNA

1. J. McCaffrey, J. Sibert, et al. CRISPR-CAS9 D10A nickase target-specific fluorescent labeling of double strand DNA for whole genome mapping and structural variation analysis. Nucleic Acids Res. 44(2), e11 (2016). doi: 10.1093/nar/gkv878 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26481349

CRISPR-Cas9 D10A nickase used with Edit-R crRNA:tracrRNA

1. S. Opp, D.A.S.A. Vieira, et al. MxB Is Not Responsible for the Blocking of HIV-1 Infection Observed in Alpha Interferon-Treated Cells. J. Virol. 90, 3056-3064 (2015). doi:10.1128/JVI.03146-15 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26719253

MxB knockout (KO) cell lines were generated by using Edit-R Cas9 Nuclease expression plasmid and crRNA:tracrRNA

1. J. Tan, Martin, SE (2016) Validation of Synthetic CRISPR Reagents as a Tool for Arrayed Functional Genomic Screening. PLoS ONE 11(12): e0168968. doi:10.1371/journal.pone.0168968

Arrayed crRNA library screening (Edit-R Ubiquitin Enzymes library)

1. H. Ogiwara, M. Sasaki, et al. Targeting p300 addiction in CBP-deficient cancers causes synthetic lethality by apoptotic cell death due to abrogation of MYC expression. Cancer Discov. 2016 Apr;6(4):430-45. doi: 10.1158/2159-8290.CD-15-0754. Epub 2015 Nov 24 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26603525

HEK293T CBP-KO cells (#2-4) bearing a 1 bp insertion in exon 9 of CBP were constructed using Edit-R Cas9 Nuclease expression plasmid and crRNA:tracrRNA

1. A. Paix, H. Schmidt, et al. Cas9-assisted recombineering in C. elegans: genome editing using in vivo assembly of linear DNAs. Nucleic Acids Res. (2016). doi:10.1093/nar/gkw502 2015
2. M.L. Kelley, Ž. Strezoska, et al. Versatility of chemically synthesized guide RNAs for CRISPR-Cas9 genome editing. J. Biotechnol. 233, 74–83 (2016). doi:10.1016/j.jbiotec.2016.06.011
3. J.F. Hultquist, K. Schumann, et al. A Cas9 Ribonucleoprotein Platform for Functional Genetic Studies of HIV-Host Interactions in Primary Human T Cells. Cell Reports. 17, 1438–1452 (2016). dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2016.09.080
4. K. He, E. Chou, et al. Conjugation and evaluation of triazole-linked single guide RNA for CRISPR-Cas9 gene editing. ChemBioChem. 17, 1809–1812 (2016).doi:10.1002/cbic.201600320

Synthetic guide RNA

• Edit-R tracrRNA

  Edit-R trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) is synthetic, HPLC-purified, long RNA required for use with Edit-R crRNA to form the complex that programs Cas9 nuclease. It is modified for nuclease resistance and can be used with modified or unmodified Edit-R crRNA.

• Edit-R synthetic positive crRNA controls and detection primers

  Species-specific crRNAs targeting well-characterized genes, as well as mismatch detection assay primers, to determine the effectiveness of your gene editing conditions for maximal efficiency.

• Edit-R synthetic crRNA non-targeting controls

  Non-targeting controls to evaluate cellular responses to CRISPR-Cas9 components in the absence of gene target-specific crRNA.

• CRISPR design tool

  Place a custom guide RNA order, or design and order your own synthetic sgRNA, crRNA, or lentiviral sgRNA with our easy-to-use interface.

• Edit-R crRNA libraries

  Plated pre-defined collections of popular gene families for arrayed knockout screening

• Cherry-pick libraries

  Have a favorite gene list? Customize and order plates of predesigned crRNA for knockout studies in your targets of interest

Cas9 nuclease

• Cas9 nuclease protein NLS

  Purified Cas9 protein ready to use for DNA-free nuclease expression.

• Cas9 nuclease mRNA

  Purified Cas9 mRNA for transient Cas9 Nuclease expression. Fluorescent options available for sorting, enrichment and visualization of delivery.

• Cas9 nuclease expression reagents

  Non-lentiviral vectors provided as endotoxin-free purified DNA for direct co-transfection with Edit-R synthetic single guide RNA or crRNA and tracrRNA.

• Lentiviral Cas9 nuclease expression reagents

  Purified lentiviral particles or plasmid DNA for generation of stable Cas9 nuclease-expressing cell populations. Constitutive or inducible promoter options are available.