CRISPR-Cas9システムは遺伝子編集アプリケーションで最もよく知られていますが、DNA切断活性を欠失させた改変Cas9ヌクレアーゼ（dead Cas9、略してdCas9）を用いることにより遺伝子発現を調節することができます。
dCas9に転写活性化因子を融合したコンストラクトと、ターゲット遺伝子のプロモーターあるいは転写開始点（TSS）に近接した領域に配列設計したガイドRNAを細胞に導入することにより、ターゲット遺伝子の転写を活性化することができます（CRISPR activation, 略してCRISPRa）。CRISPRaシステムは複数あります。CRISPRa用のガイドRNAのプール化ライブラリーを用いたスクリーニングにより遺伝子機能獲得研究に成功してきました。しかし、多くの生物学的に関連する表現型は迅速に分類できないため、アレイ化スクリーニングがより良いアプローチになります。
化学合成ガイドRNAは遺伝子機能獲得解析において明確な利点がある
Horizonの科学者は、crRNAの5 ‘末端の2つのヌクレオチドとtracrRNAの3’末端の２つのヌクレオチドが、2‘-O-メチルヌクレオチドとホスホロチオエート骨格結合で化学修飾された化学合成ガイドRNAを開発しました。これらのガイドは、第2世代のCRISPRaシステム（正規のtracrRNAを使用するVPRシステムまたはMS2アプタマー配列を含むtracrRNAを利用するSAMシステム）でうまく機能します。これらの化学合成ガイドRNAは、対照の発現ベクターと比較して、同等またはそれ以上の遺伝子転写活性化レベルを示します。遺伝子のプロモーター領域を標的とする複数の化学合成ガイドRNAは、dCas9活性化因子と協調して作用し、ターゲット遺伝子の転写活性化を促進します。さらに、化学合成ガイドRNAはマルチプレックスに最適です。同じ細胞内で複数の遺伝子の転写を活性化できるため、これらの試薬はパスウェイ分析や細胞ネットワークの発見に最適です。
化学合成ガイドRNAは、VPRおよびSAM CRISPRaシステムで強力な転写活性化を実現
（図は、The Journal of Biotechnologyに掲載のHorizonの論文 "CRISPR-mediated transcriptional activation with synthetic guide RNA." から引用）dCas9-VPRを用いた CRISPRaシステムでは、3種類の転写活性化因子（VP64、p65、Rta）を融合させた改変Cas9 ヌクレアーゼ（dCas9-VPR）と、ターゲット遺伝子のプロモーターあるいは転写開始点（TSS）に近接した領域に配列設計したガイドRNA（crRNA：tracrRNAと表記）を細胞内に導入し、ターゲット遺伝子の転写を活性化します。crRNA：tracrRNAは、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の上流のゲノムDNAに結合します。2′-O-メチルヌクレオチドとホスホロチオエート骨格結合の化学修飾をアスタリスクで示しています。相乗的活性化メディエーター（Synergistic activation mediator、略してSAM）を用いたCRISPRaシステムは、以下の3つのコンポーネントで構成されています：（1）転写活性化因子VP64と融合したdCas9（dCas9-VP64）、（2）転写活性化因子のMS2-p65-HSF1融合タンパク質、（3）tracrRNAのステムループ2にMS2アプタマーを含むガイドRNA（crRNA：SAM tracrRNAと表記）。crRNA：SAM tracrRNAはdCas9-VP64に結合し、アプタマーはMS2-p65-HSF1融合タンパク質に結合します。これらの活性化因子の組み合わせを含むこの複合体は、転写開始部位（TSS）領域のプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の上流のゲノムDNAに結合して、ターゲット遺伝子を活性化します。 U2OS-dCas9-SAM細胞（灰色のバー）およびU2OS-dCas9-VPR細胞（黒色のバー）に、複数のcRNAをプール（混合）した化学合成crRNA：SAM tracrRNAおよびcrRNA：tracrRNAをそれぞれトランスフェクトしました。転写の活性化倍率は、RT-qPCRを使用してトランスフェクションの72時間後に測定し、ネガティブコントロール（NTC）に対して正規化しました。
dCas9-VPR mRNAおよび化学合成ガイドRNAを用いた一過的な遺伝子転写活性化
dCas9-VPR mRNAを化学合成ガイドRNAとともに細胞に導入することにより、一過的な遺伝子転写活性化が可能です。dCas9-VPR mRNAを含む細胞を、EGFPレポーターまたはピューロマイシン選択マーカーのいずれかを用いて濃縮することにより、転写活性化を強化することができます。
化学合成ガイドRNAは、遺伝子転写活性化のためにdCas9-VPR mRNAとともに使用可能
dCas9-VPR mRNAと化学合成ガイドRNAを使用したCRISPRaのワークフローを図に示しました。 dCas9-VPR-EGFP mRNAおよび、IL1R2遺伝子をターゲットとするcrRNA：tracrRNAをU2OS細胞に共導入しました。トランスフェクションの24時間後に、細胞を次のカテゴリーに分類しました（EGFPの蛍光強度）：陰性、薄暗い、または上位10％。転写活性化はRT-qPCRを使用して測定しました。 dCas9-VPR-puromycin mRNAおよび、IL-1R2・TFAP2C・TTNの各遺伝子をターゲットとするcrRNA：tracrRNAをU2OS細胞に共導入しました。トランスフェクションの24時間後、ピューロマイシンで24時間細胞を選択し、転写活性化を測定しました。
アレイ化CRISPRaスクリーニングの原理実証試験
リポフェクション法またはエレクトロポレーション法のいずれかによって、マルチウェルプレートに分注した細胞に、化学合成ガイドRNAを均一に導入することができます。dCas9-VPR安定発現細胞に化学合成ガイドRNAを導入すると、24時間で有意なCRISPR遺伝子活性化が引き起こされ、48〜72時間でピークに達し、5日間でも持続します。細胞を分割する必要のないこの2〜5日の時間枠は、多くの標準的な細胞ベースのアッセイの時間枠と同様であり、従来のsiRNAスクリーニングの場合のような、アレイ化スクリーニングでの自動化とアプリケーションを可能にします。
Horizonの科学者は、CRISPRa crRNAライブラリーを使用してアレイ化スクリーニングの原理実証試験を実行しました。具体的には、153種類のサイトカイン受容体遺伝子の発現をアップレギュレートし、IL-6サイトカイン分泌の正および負の調節因子を特定しました。
化学合成crRNAを用いたCRISPRaアレイ化スクリーニングによるIL-6レギュレーターの同定
dCas9-VPRを安定発現するU2OS細胞にCRISPRa crRNAライブラリーをトランスフェクトしました。CRISPRa crRNAライブラリーは、153種類のサイトカイン受容体の各遺伝子をターゲットとする4つのデザイン済み化学合成crRNAのプール（混合物）を、プレートの各ウェルに分注したものを使用しました。トランスフェクションの72時間後に細胞上清を回収し、IL-6をELISAアッセイで測定しました。ネガティブコントロール（NTC）によって正規化したIL-6の分泌増減率変化を、p値に基づいて色分けして図示しました（正のレギュレーターは赤色、負のレギュレーターは青色）。
化学合成ガイドRNAを使用すると、より複雑な表現型の読み取り法を使用できるハイスループットのアレイ化スクリーニングアプリケーションでCRISPRaを利用でき、プール化ライブラリーを用いたスクリーニングで通常使用される生存率および薬剤耐性アッセイを補完できます。
Written by Dr. Žaklina Strezoska
ŽaklinaStrezoskaは、コロラド州ラファイエットにあるHorizon Discoveryの生物学R＆Dディレクターです。彼女は経験豊富な分子生物学者と細胞生物学者のチームを率い、遺伝子調節とゲノム工学のための革新と新製品開発に焦点を当てたプロジェクトを監督しています。彼女はイリノイ大学シカゴ校で分子遺伝学の博士号を取得し、ブラウン大学でポスドク研究を完了しました。
The Journal ofBiotechnologyの全文はこちらから
CRISPR-mediated transcriptional activation with synthetic guide RNA. Strezoska, Ž., et al. J. Biotechnology. 319: 25-35, 2020. doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.005