siRNAノックダウン保証

ON‑TARGETplus 2.0 siRNA試薬（SMARTpoolおよびindividual siRNAの4種類のうち3種類）について、最適な導入条件下で使用された場合に、qPCRで測定したmRNAレベルでnon-targetingコントロールと比較して少なくとも75％の遺伝子発現抑制を保証します。最適な導入条件は、Dharmaconの検証済みポジティブコントロールを使用して確認し、100 nMのsiRNAを用いてトランスフェクションを行い、導入後24〜72時間の時点で測定されたデータに基づきます。

Note：当社では100 nMで75％以上のノックダウンを保証していますが、ほとんどのON TARGETplus 2.0 siRNA製品は5〜25 nMの作業濃度で高い機能を示します。オンターゲット効果を最大化し、オフターゲット挙動を最小限に抑えるため、濃度の滴定を推奨します。最適な導入条件や作業濃度は実験系によって異なります。

ご質問やsiRNA製品の最適な使用方法についてのご相談は、テクニカルサポートまでお問い合わせください。

ノックアウト実験を完成させるために、以下のサポート試薬も併せてご検討ください。

ON‑TARGETplus 2.0 siRNAコントロール

次世代のON-TARGETplus 2.0 siRNA用に設計された検証済みポジティブコントロールおよびnon-targetingネガティブコントロールで、当社独自のON TARGETplus合成修飾を特徴とし、優れた特異性とオフターゲット効果の低減を実現しており、プールタイプまたは単一siRNAとして提供しています。

ON-TARGETplus 2.0コントロールsiRNAは、特異性の向上、シード領域に起因するオフターゲットの低減、そして実験間の一貫性の向上を実現します。これらのコントロールは、ON TARGETplus 2.0試薬を使用するすべてのsiRNAワークフローでの使用を推奨します。追加のオフターゲット低減が必要な場合にはプールタイプのsiRNAコントロールを推奨しており、ON TARGETplus 2.0プールsiRNA試薬と併用するのに適しています。

実験に使用する細胞で強く発現しているハウスキーピング遺伝子を効率的にサイレンシングする適切なポジティブコントロールを選択することで、試薬が適切に機能していることを確認してください。

トランスフェクション試薬

DharmaFECTトランスフェクション試薬は、デリバリーの改善と毒性の低減のために最適化されています。実験に最適なDharmaFECT試薬は、細胞のタイプによって異なります。

注文数量ガイドライン

ON-TARGET plus試薬は、通常5〜25 nMの濃度で使用されます。以下の計算は、25 nMの場合の推定値であり、ピペッティングエラーは考慮されていません。

ON‑TARGETplus 2.0は、ON‑TARGETplusが確立した標的遺伝子ノックダウンの高い性能を維持する

U2OS または HCT-116 細胞に、AHCY 遺伝子（左）または PRDX1 遺伝子（右）を標的とする 25 nM の ON-TARGETplus または ON-TARGETplus 2.0 siRNA、あるいはnon-targetingコントロール（NTC）siRNA を、0.2 µL/ウェル の DharmaFECT 4 （U2OS）または DharmaFECT 2（HCT-116）を用いてトランスフェクションしました。48時間後に全RNAを抽出し、RT qPCRにより相対的遺伝子発現量を測定しました。各遺伝子の相対発現量は、ACTBをハウスキーピング遺伝子として∆∆Cq法により算出し、NTCに対して正規化しました。ON TARGETplusおよびON TARGETplus 2.0の両siRNAで強固な標的遺伝子ノックダウンが観察されました。各群につき生物学的に独立したサンプルをn=2用いました。

ON TARGETplusおよびON TARGETplus 2.0 siRNAは、グローバルな遺伝子発現への影響を最小限に抑えながら、TP53 mRNA発現を強力に低下させる

U2OS細胞に対し、TP53遺伝子を標的とする25 nMのON-TARGETplusまたはON-TARGETplus 2.0 siRNA、もしくはnon-targetingコントロール（NTC）siRNAを、0.2 µL/ウェル DharmaFECT 4を用いてトランスフェクションしました。A. 48時間後、全RNAを抽出し、RNAseqまたはRT-qPCR用に調製しました。A. 全転写産物発現量（transcripts per million：TPM）の分布を示すヒストグラムとしてプロットしたデータ。4つのsiRNA処理群全てにおいてTP53 mRNA発現の顕著なダウンレギュレーションが観察され、x軸上に示され、対数変換されたTPM倍変化率として表されています。一方、全体的な遺伝子発現は対応するNTC siRNAと比較してほぼ変化がありませんでした。各群につき生物学的に独立したサンプル2個（n=2）を使用しました。B. 相対的遺伝子発現量はRT-qPCRにより測定しました。TP53の相対発現量は、ACTBを内在性コントロール遺伝子として用いたΔΔCq法により算出され、NTCに対して正規化されました。ON-TARGETplusおよびON-TARGETplus 2.0 siRNAの両方において、標的遺伝子の強固なノックダウンが確認されました。各群につき生物学的に独立したサンプル2個（n=2）を使用しました。

ON TARGETplus 2.0は、トランスクリプトームの拡張により新たに明らかになったオフターゲット効果を低減する

U2OS または HEK293T 細胞に、YY1AP1 遺伝子を標的とする 25 nM の ON-TARGETplus または ON-TARGETplus 2.0 siRNA、あるいはnon-targetingコントロール（NTC）siRNA を、DharmaFECT 1 (HEK293T) または DharmaFECT 4 (U2OS) を 0.2 µL/ウェル添加してトランスフェクションを行いました。48時間後、全RNAを抽出し、RNAseqまたはRT-qPCR用に調製しました。A. U2OS細胞における全転写産物発現量（transcripts per million：TPM）の分布を示すヒストグラムとしてプロットしたデータ。4つのsiRNA処理群すべてでYY1AP1 mRNA発現の顕著なダウンレギュレーションが観察され、これはx軸上に示され、log2変換したTPMフォールドチェンジとして表されています。一方、グローバルな遺伝子発現は対応するNTC siRNAと比較してほとんど変化がありませんでした。特筆すべきは、ON-TARGETplus siRNAがオフターゲット遺伝子GON4Lの発現も減少させたのに対し、ON-TARGETplus 2.0 siRNAは高い特異性を維持しGON4L発現に影響を与えなかった点です。各群につき生物学的に独立したサンプル2個（n=2）を使用しました。B. 相対的遺伝子発現量はRT-qPCRにより測定しました。各遺伝子の相対発現量は、ACTBをハウスキーピング遺伝子として用いたΔΔCq法により算出され、NTCに対して正規化されました。ON-TARGETplusおよびON-TARGETplus 2.0 siRNAの両方で標的遺伝子の強力なノックダウンが観察されましたが、ON-TARGETplus siRNAはオフターゲット遺伝子であるGON4Lの発現も減少させることが判明しました。ON-TARGETplus 2.0 siRNAは高い特異性を維持し、GON4Lの発現に影響を与えませんでした。各群につき生物学的に独立したサンプル2個（n=2）を使用しました。

ON TARGETplus修飾はオフターゲット数を低減し、プール化によりさらに低減する

パネル（A）および（B）は、（A）単一siRNAおよび（B）SMARTpool試薬に対してON TARGETplus修飾を適用した場合と適用しない場合のオフターゲットシグネチャの代表例です。緑色のバーは、指定されたsiRNA試薬で処理した際に発現が2倍以上低下した遺伝子を示しています。ON TARGETplus修飾は未修飾siRNAと比較してオフターゲットを低減しました。siRNAのプール化とON TARGETplus修飾は、それぞれ単独でも、また組み合わせでも、オフターゲット遺伝子サイレンシングを大幅に低減します。パネル（C）は、10種類の異なる遺伝子（各遺伝子につき4種類のsiRNAまたは1種類のSMARTpool試薬）を標的とする指定siRNA試薬によって誘導されたオフターゲット（2倍以上のダウンレギュレーション）の定量結果を示しています。オフターゲットはマイクロアレイ解析（Agilent）により定量化し、その後集計しました。影付きの各ボックスは、データセットの中央の50％を表します。
ボックス内の水平線：データセットの中央値
縦棒：最小および最大のデータ値

ON TARGETplus SMARTpool試薬は、標的遺伝子ノックダウンを維持しながら、オフターゲットによる誤った表現型を低減する

ARPC1Bのサイレンシングが細胞遊走に及ぼす影響を乳がん細胞株で評価しました。細胞の単層に均一なスクラッチを入れ、スクラッチ（創傷）を閉じるまでの細胞遊走速度（創傷治癒）を評価しました。未修飾およびON-TARGETplus siRNA試薬のいずれも、強力な標的ノックダウンを誘導しました。未修飾の個別siRNAをトランスフェクトした細胞では、オフターゲット効果による一貫性のない表現型（赤枠）が観察されました。未修飾SMARTpoolは偽の表現型を大幅に改善しましたが、ON-TARGETplus SMARTpoolはオフターゲット効果を著しく低減して一貫した表現型を示しました。

Harvard Medical School の Kaylene Simpson 氏、Laura Selfors 氏、Joan Brugge 氏との共同研究によるものです。

ON TARGETplus修飾は、両方のsiRNA鎖に作用することで高いサイレンシング性能を実現する

ON-TARGETplusの二本鎖化学修飾は、まずセンス（パッセンジャー）鎖がRISCへの取り込みを阻害されることから始まります。これにより、アンチセンス（ガイド）鎖のロードが促進され、パッセンジャー鎖によるオフターゲットが減少します。しかしながら、siRNAのオフターゲットの大部分は、ガイド鎖のシード領域によって引き起こされます。ON TARGETplusは、このシード領域内に修飾を施すことでmiRNA様の活性を不安定化させ、特異性を高め、標的に対するノックダウン性能を向上させています。

低頻度シード領域をもつsiRNAデザインは、オフターゲットをより少なく抑える

ON-TARGETplus siRNAデザインは、高度なバイオインフォマティクスを活用し、高頻度または高度に保存されたmiRNAシード領域に起因するmiRNA様オフターゲットの可能性を低減します。低頻度のシードを有するsiRNAは、中頻度または高頻度のシードを有するsiRNAと比較して、オフターゲットの数が有意に少なくなります。低頻度・中頻度・高頻度のシード領域をもつ5種類のsiRNAをHeLa細胞にトランスフェクションし、グローバル発現プロファイリング（Agilent 22Kプラットフォーム）により関連するオフターゲットシグネチャを評価しました。siRNA配列は位置1および8-19で固定され、シード領域（位置2-7）のみを変更しました。

低頻度シード：HeLaトランスクリプトーム中で350回未満の出現

中頻度シード：2,500〜2,800回の出現

高頻度シード：3,800回超の出現

1. A. L. Jackson et al., Position-specific chemical modification increases specificity of siRNA-mediated gene silencing. RNA. 12(7), 1197-1205 (July 2006).
2. A. Birmingham et al., 3'-UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nature Methods. 3(3), 199-204 (March 2006).
3. E. M. Anderson et al., Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity. RNA. 14(5), 853-861 (May 2008).

Please see our full FAQ page for all commonly asked questions about our products.

1. What is the difference between ON-TARGETplus legacy and OTP 2.0?

OTP 2.0 is a next-generation upgrade of the original ON-TARGETplus siRNA. It features improved design algorithms, continuous transcriptome realignment, and updated sequence ranking to enhance specificity, minimize off-target effects, and ensure consistent gene knockdown. In contrast, legacy OTP designs were based on earlier transcriptome data and do not include these ongoing optimizations.

2. How does OTP 2.0 reduce off-target effects?

Each siRNA is designed using updated transcriptome data and advanced ranking algorithms that prioritize specificity. Seed-region optimization and refined design parameters help minimize unintended interactions.

3. Are OTP 2.0 siRNAs guaranteed to knock down my target gene?

Yes. OTP 2.0 siRNAs are backed by a guaranteed gene knockdown standard, ensuring consistent and dependable performance when used under recommended conditions.

4. In what formats are OTP 2.0 siRNAs available?

OTP 2.0 is offered as individual siRNAs or as SMARTpool reagents (a blend of four different siRNAs designs targeting the same gene). Plate-based formats are available to support screening workflows.

5. Can OTP 2.0 be used in high-throughput or automated platforms?

Absolutely. OTP 2.0 siRNAs are available in formats compatible with automated systems, including plates suitable for high-throughput applications.

6. Are OTP 2.0 siRNAs available for multiple species?

Yes. Pre-designed OTP 2.0 siRNAs are available for human, mouse, and rat gene targets.

7. How does OTP 2.0 support genome-wide and gene-family studies?

OTP 2.0 collections cover whole-genome libraries as well as focused sets for commonly studied gene families, enabling both broad and targeted screening approaches. In addition, cherry-pick libraries can be built for desirable targets.

8. Can OTP 2.0 be used alongside Edit-R CRISPR reagents?

Yes. OTP 2.0 serves as an ideal orthogonal method to validate CRISPR screening hits or complement gene knockout studies with gene knockdown testing.