コストのかかる自動化を必要とせずに、数百または数千の遺伝子をスクリーニング
プール化レンチウイルススクリーニングを利用し、細胞応答とシグナル伝達経路を調節する遺伝子を特定したり、新しい遺伝子機能を発見できます。プール化スクリーニングライブラリーは、わずか50個のコンストラクトから最大1000個のコンストラクトまで構成することができます。アレイ化スクリーニング（個別にアレイ化された試薬を使用、リードアウトを自動化で測定）と比較すると、プール化スクリーニング用ライブラリーは、少数の細胞培養用ディッシュ内で形質導入し、細胞集団をスクリーニングすることができます。
高いfold-representationを維持するために必要な条件など、プール化レンチウイルススクリーニングを成功させるための重要なパラメーターの詳細については、次の出版物をダウンロードしてください: Ž. Strezoska, A. Licon, Optimized PCR Conditions and Increased shRNA Fold Representation Improve Reproducibility of Pooled shRNA Screens. PLoS One 7, e42341 (2012).
すべてのHorizonプール化レンチウイルスライブラリーには以下が含まれます：
- 精製され濃縮されたレンチウイルス粒子として提供される高品質のプール
- 遺伝子ファミリーまたは全ゲノムライブラリー
- カスタムコレクションライブラリーの提供可能。こちらからお見積りをご依頼ください。
- プール化レンチウイルススクリーニングを成功させるための実験計画用ワークシート、および検証済みのプロトコール
検証済みのプール化レンチウイルスのスクリーニングプロトコールで推奨しているHorizon製品：
- 最適化および検証済みのベクター特異的プライマーキット（以下の目的用に設計されています）
- バイアスを最小限に抑えた効率的なゲノムDNAのPCR増幅
- ヒット同定のためのハイスループットマルチプレックスシーケンシング
プール化shRNAスクリーニングの成功は、高品質のプールの使用がもたらす
すべてのHorizonレンチウイルスプール化ライブラリーは、実験的に検証された方法を使用して作製され、すべてのレンチウイルスプールでコンストラクトの均一な存在量（representation）を保証します。プーリング後、大腸菌培養物からDNAを調製し、ハイスループットシーケンスによって分析して、コンストラクトのrepresentationと同一性を評価します。この品質管理により、Horizonは、コンストラクトの95%以上がプーリングプロセス後に回収され、コンストラクトの70%の存在量が互いに5倍未満の差であり、コンストラクトの90%の存在量が互いに25倍未満の差であることを確認できます。この品質管理により、Horizonのプールされたスクリーニング用ライブラリーの均一性と、コンストラクトのrepresentationの変化を検出する能力に対する信頼が提供されます。
プラスミドDNAは、254の遺伝子をターゲットとする1561のshRNAを含むDecode Phosphataseグリセロールストックプールから調製されました（A）。ゲノムDNAは、1000倍のshRNA representationでDecode Phosphataseライブラリーを形質導入したHEK293T細胞から調製されました（B）。両方のDNAサンプルをIllumina Hi-Seqでシーケンスして、サンプルに含まれるshRNAを決定しました。正規化されたlog2カウントのヒストグラムは、プーリングプロセス（グリセロールストック）後およびレンチウイルス粒子による形質導入後に回収されたshRNAが狭い分布で存在することを示しています。これにより、スクリーニング実験で各shRNAが十分に存在することが確保されます。
プール化スクリーニングを成功させるには、コンストラクトの高いfold-representationが必要
スクリーニングを成功させ、質の高いヒットを特定するためには、スクリーニングを高いfold-representation（プール化ライブラリー内の任意のコンストラクト（shRNAなど）がスクリーニングにおいて存在する範囲）で行うことが重要です。高いfold-representationは、生物学的レプリケート間の再現性を高め、表現型選択後のコンストラクトの存在量の変化を検出するための十分な実験ウィンドウがあることを保証します。
Horizonは、信頼性の高いヒットを再現性よく特定するために必要なツールを提供します。
- 構成的プロモーターを搭載した全てのレンチウイルススクリーニング用ライブラリーは、複数の生物学的レプリケートを形質導入するのに十分な量の濃縮（108 TU/mL以上）レンチウイルス粒子として提供されます。誘導性レポーターを搭載したライブラリーは107 TU/mL以上で提供されます。
- 最適化され、実験的に検証された製品特異的PCRプライマーは、最小限のバイアスでゲノムDNAを効率的に増幅し、コンストラクト存在量をハイスループットシーケンスにより解析することを可能にするように設計されています。
- 十分な量のレンチウイルス粒子、PCRおよびシーケンシングプライマーにより、スクリーニングプロセス全体を通して高いfold-representationを維持できます
10,000のshRNAを用いたスクリーニングを、100倍（赤）および500倍（青）のshRNA representationで行い、2倍の濃縮と枯渇を検出した場合のROC（Receiver Operating Characteristic）曲線。500倍スクリーニングは、100倍スクリーニングよりもROC曲線の下の領域が大きく、真陽性率が高いと言えます。これは500倍スクリーニングが濃縮および枯渇したshRNAを検出する優れた能力を示しています。
レプリケート間の再現性は、次の実験プロトコールによるPCRステップで維持される
Decode phosphataseライブラリーは、1,000倍のrepresentationでHEK293T細胞に導入されました。細胞をピューロマイシンで72時間選択し、ゲノム（gDNA）を抽出しました。Decode PCRプライマーを使用して、示されたfold-representationでshRNA配列を増幅しました。各PCRの技術的レプリケートを比較して、再現性（ピアソン相関）を決定しました。ここで、1.0はサンプルが100%同一であることを示します。
プール化スクリーニングを成功させるには、各コンストラクトの高いfold-representationが必要である
情報伝達からヒット同定まで、プール化スクリーニングワークフローの各ステップは、経験的にテストされています。均一な増幅と高い再現性を確保するための増幅条件が特定されました（Strezoska et al. 2012）。Dharmaconプール化スクリーニングシステムには、Illumina社NGSでのハイスループットシーケンシングによるgDNAからのヘアピン配列の同定のためのIllumina社NGS適応PCRプライマーが含まれています。DecodeおよびSMARTvectorプライマーペアは、熱力学的バイアスと表現の変動を最小限に抑えながら、コンストラクトを効率的に増幅できるように最適化されています。さらに、PCRプライマーにはアダプターとインデックス配列が組み込まれており、研究者はPCR増幅からIllumina社NGSのハイスループットシーケンスに簡単に移行できます。ヘアピンインサートの直接同定により、データ解析が容易になり、正確な標的遺伝子の同定が保証されます。
PCR増幅とIllumina社のハイスループットシーケンスワークフロー
Illumina社NGSに適合したプライマーとPhusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymeraseを使用して、組み込まれたshRNA配列をPCR増幅し、Illumina社NGSフローセル結合配列を追加します。得られたアンプリコンはシーケンシングプライマーを使用してIllumina社NGSで実行します。スクリーニング中に濃縮または枯渇したshRNAはヒットとして同定され、それらが標的とする遺伝子が同定されます。ヒットは、個々のGIPZレンチウイルスshRNAを使用して確認し、さらに調べることができます。
次世代シーケンシングプロトコールは再現性があるため、実験ノイズが減少し、ヒットがより簡単に同定可能
Decode Phosphataseプール化スクリーニングライブラリーを、1000倍のshRNA representationでHEK293T細胞に形質導入しました。細胞をピューロマイシンで72時間選択し、ゲノムDNA（gDNA）を抽出しました。Decode PCRおよびシーケンシングプライマーを使用して、gDNAサンプルを2つのテクニカルデュプリケート（青）および2つの異なる形質導入（赤）として増幅およびシーケンスし、Illumina社ハイスループットシーケンスによってカウントを分析しました。各レプリケートのshRNAのlog2カウントは、互いにプロットされています。
Learn more about Custom Pools
SMARTvector lentiviral shRNA、SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA、shMIMIC Lentiviral microRNA、shMIMIC Inducible Lentiviral microRNA、またはヒト、マウス、またはラット用のGIPZコンストラクト（利用可能な場合）から選択できます。
- 利用可能なプールサイズ：50～10,000コンストラクト
- プールは、精製され濃縮されたレンチウイルス粒子として提供されます（構成ベクターの場合は5 x 108 TU/mL以上、誘導ベクターの場合は1 x 107 TU/mL以上）。
- レンチウイルス粒子の量を選択します（最小量100 μL）。
- ウイルス産生の前に、プールはNGS分析によってコンストラクトの回収と均一性について分析します。
- コンストラクト配列、RefSeq遺伝子アクセッション、Entrez遺伝子IDまたはmiRBase遺伝子IDを含むデータファイルを提供します。
検証済みのプール化レンチウイルススクリーニングプロトコールで推奨しているHorizon製品：
- トランスダクション最適化のためのnon-targetingコントロールレンチウイルス
- Vector-specific Indexing PCRおよびSequencing Primer Kitsには、最適化され、実験的に検証されたプライマーを含む
- バイアスを最小限に抑えた効率的なゲノムDNAのPCR増幅
- ヒット同定のためのハイスループットマルチプレックスシーケンシング
- プール化レンチウイルススクリーニングを成功させるための実験的にテストされたプロトコールと計画ツール
見積もりをリクエストする前に、次のマニュアルやツールをダウンロードして、プール化レンチウイルススクリーニングを慎重に計画し、必要なコンポーネントの量を計算することが非常に重要です。
重要なお知らせ
プール化レンチウイルススクリーニング用ライブラリーおよび試薬は、以下に示す封じ込め措置および適用される法律および規制が満たされている研究所での内部研究使用のみを目的としています（製品利用規約に規定されているとおり）。製品は、診断、治療、またはその他の商業目的で使用することはできません。また、ヒトに対してはいかなる目的であっても投与することはできず、動物に対しては治療目的で投与することはできません。レンチウイルス粒子として提供されるすべてのプール化レンチウイルススクリーニング用ライブラリーは、複製能力がなく、自己不活化（self-inactivating: SIN）であり、非病原性（感染性ヒト疾患を引き起こさない）です。
レンチウイルス粒子製品を購入する研究者は、レンチウイルスベクター粒子の取り扱いに関する特定のガイドラインについて、所属機関の健康およびバイオセーフティ担当者と相談する責任があります。さらに、各研究者は、複製能のないSINレンチウイルスベクターおよび複製欠損レンチウイルス粒子を使用した研究について、その地域の管轄区域および機関における必要な許可を取得する全責任を負います。
