SMARTvector Lentiviral shRNAプール化ライブラリー

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SMARTvector Lentiviral shRNAプール化ライブラリー

SMARTvector Lentiviral shRNAプール化ライブラリー

最適化された機能分析スクリーニングのための恒常発現用shRNA

プロモーターと蛍光レポーターは選択でき、分裂細胞または非分裂細胞で数百～数千のshRNAの機能スクリーニングを実行します。

信頼性の高い機能分析スクリーニングを得るための最適なshRNA発現

Horizonの最先端のshRNAプラットフォームであるSMARTvector Lentiviral shRNAは、プロモーターとレポーター選択が柔軟であり、最先端の合理的な設計アルゴリズムと組み合わせて、ヒト、マウス、およびラットのタンパク質コードおよび長い非コード遺伝子の完全なゲノムをターゲットにします。

プール化Lentiviralライブラリーは、多数の遺伝子をスクリーニングするための効率的で費用効果の高い方法を提供します。ライブラリーの構築、プーリング技術、およびハイスループットシーケンス対応のスクリーニングワークフローは、再現性と正確なヒット識別を確実にするために実験的に検証されています。プール化lentiviralスクリーニングライブラリーのページで最適なライブラリー設計とプール化スクリーニングワークフローについて学ぶことができます。

Highlights:

SMARTvector Lentiviral shRNAによる強力なshRNA発現のための革新的なベクター設計を採用
SMARTchoiceオプションでは、プロモーター*とレポーター（または非搭載）を選択して、実験のパフォーマンスの最適化を実現
ノックダウンを最大化し、オフターゲットを最小化する合理的に設計されたshRNAを含有

Tet-On® 3Gトランスアクチベータータンパク質による厳密な発現制御が必要な場合は、SMARTvector inducible lentiviral shRNAを選択してください。

* 一部のプロモーターオプションは、カスタム試薬として、またはリクエストに応じてのみ利用できる場合があります

各SMARTvector Lentiviral shRNAライブラリーには、以下が含まれます。

レンチウイルス粒子
- 5000 コンストラクト以下の場合：ライブラリー総量200 µL (8 x 25 µL), 5 x 10⁸ TU/mL ± 20％
- 5001 コンストラクト以上の場合：ライブラリー総量400 µL (16 x 25 µL), 5 x 10⁸ TU/mL ± 20％
100のnon-targetingコントロールコンストラクト
遺伝子特異的コントロールとして34のヒトまたはマウスのタンパク質コード遺伝子を標的とする272（遺伝子あたり8つのshRNA）のコンストラクト（一般的なリファレンス遺伝子（PPIB, GAPD, Actin, Lamin）および生存関連遺伝子が含まれます）
コンストラクト配列、ターゲット遺伝子ID、数百万のマッピングされたリードごとのカウントを含むデータファイル

ヒトおよびマウスについては、遺伝子ファミリーから全ゲノムまでの組み合わせ済みSMARTvector Lentiviral shRNAライブラリーをご用意しています。ラット用のライブラリーおよびカスタムSMARTvector Lentiviral shRNAコレクションは、ご要望に応じてご用意可能です。

shRNAのカスタムSMARTvector Lentiviral shRNAコレクション
50～10,000のコンストラクトのプールとしてご利用いただけます。
精製、濃縮されたレンチウイルス粒子としてご提供
恒常型発現ベクター力価：5 x 10⁸ TU/mL以上、誘導発現ベクター力価：1 x 10⁷ TU/mL以上

カスタムプール化ライブラリーの価格はお問い合わせください。

ご注文前に、以下の資料より、プール化Lentiviral shRNAスクリーニングを慎重に計画し、必要なコンポーネントの量を計算してください。

SMARTvector & shMIMIC lentiviral pooled libraries technical manual
Pooled Lentiviral Screening Laboratory Protocols & Calculation Tracking Worksheet

検証済みのプロトコールで必要な試薬：

トランスダクションの最適化のための、適切なSMARTvector non-targetingコントロール
SMARTvector Indexing PCR and Sequencing Primer Kits (A & B) ：12種類のユニークなインデックスプライマーを含み、以下のような実験に最適化され、実験的に検証されています。
- 最小限のバイアスでゲノムDNAを効率的にPCR増幅
- ヒット識別のためのハイスループット多重化次世代シーケンシング

SMARTvector Lentiviral shRNAプールライブラリーカバレッジ *:

* アノテーションは RefSeq v65に基づいています。カバレッジとshRNA数は予告なく変更する場合があります。
Collection	Human		Mouse
	# targeted genes	Number pools and average shRNA per pool	# targeted genes	Number pools and average shRNA per pool
Genome	19241	16 pools of 9513 shRNA	21745	18 pools of 9502 shRNA
Druggable genome	7341	6 pools of 9735 shRNA	9723	8 pools of 9670 shRNA
GPCR	377	1 pool of 3012 shRNA	494	1 pool of 3909 shRNA
Ion channel	340	1 pool of 2709 shRNA	332	1 pool of 2646 shRNA
Phosphatase	245	1 pool of 1948 shRNA	268	1 pool of 2141 shRNA
Protease	466	1 pool of 3702 shRNA	529	1 pool of 4206 shRNA
Protein kinase	702	1 pool of 5602 shRNA	697	1 pool of 5558 shRNA
Ubiquitin conjugation	557	1 pool of 4431 shRNA	511	1 pool of 4069 shRNA
Apoptosis	**
Cell cycle regulation	**
De-ubiquitinating enzymes	**
Membrane trafficking	**
DNA damage response	**
Epigenetics	**
Nuclear receptor	**
Transcription factors	**

重要なお知らせ

SMARTvector Lentiviral shRNAプールライブラリーは、以下に記載されている封じ込め措置および適用される法律と規制が満たされているラボでの（製品の利用規約に記載されている）内部研究での使用のみを目的としています。試薬は、診断、治療、またはその他の商業目的で使用することはできません。また、いかなる目的でもヒトに、治療目的で動物に投与することはできません。 SMARTvector Lentiviral shRNAのプール化ライブラリーは、複製能が欠損し、自己不活化（SIN）で非病原性（感染性のヒト疾患を引き起こさない）のレンチウイルス粒子として提供されます。

レンチウイルス粒子試薬を購入した研究者は、レンチウイルスベクター粒子の取り扱いに関する特定のガイドラインについて、所属機関の健康およびバイオセーフティ担当者に相談する責任があります。さらに、各研究者は、使用する研究に必要な許可を取得した上で、自己不活化（SIN）レンチウイルスベクターおよび自己複製能欠損レンチウイルス粒子を地域の管轄区域および機関に受け入れる責任を負います。

SMARTvector Lentiviral shRNAベクターデザイン

Vector Element	Utility
5' LTR	5' Long Terminal Repeat necessary for lentiviral particle production and integration of the construct into the host cell genome
Ψ	Psi packaging sequence allows viral genome packaging using lentiviral packaging systems
PRRE	Rev Response Element enhances titer by increasing packaging efficiency of full-length viral genomes
tGFP or tRFP	TurboGFP or TurboRFP reporter for visual tracking expression upon doxycycline induction
None	No-reporter option for use in applications where fluorescence is not required or desired
IRES	Internal Ribosomal Entry Site allows expression of fluorescent marker and puromycin resistance in a single transcript
PuroR	Puromycin resistance permits antibioticselective pressure and propagation of stable integrants
SMARTvector universal scaffold	Optimized proprietary scaffold in which mature microRNA sequence is embedded
WPRE	Woodchuck Hepatitis Post-transcriptional Regulatory Element enhances transgene expression in target cells
3' SIN LTR	3' Self-inactivating Long Terminal Repeat for increased Lentiviral safety

SMARTvectorプール化スクリーニングワークフロー

アッセイの開発と最適化：最適な実験条件を確立します。これには、a）レンチウイルスの形質導入、b）選択圧やアッセイ時間などのスクリーニングパラメーターが含まれます。一次スクリーニング：細胞当たり１つのshRNAコンストラクトを発現させるために、低MOIでレンチウイルスプールを細胞に形質導入します。レンチウイルスの感染した細胞を、対照用サンプルと選択圧をかける処理用サンプルに分けます。処理用サンプルに選択圧をかけた後、対照用サンプルおよび処理用サンプルの細胞それぞれからゲノムDNAを抽出します。イルミナに適合したプライマーとPhusion Hot-Start II High Fidelity DNA Polymeraseを使用して、ゲノム中に挿入されたshRNAコンストラクト配列をPCR増幅し、アダプター付加したPCR増幅断片をillumina flow cellに固定化します。結果的に生じるアンプリコンをIlluminaシークエンサーによりシークエンシングします。ヒットの識別とフォローアップ：コンストラクト配列を、対照用サンプルおよび処理用サンプルで識別します。スクリーニング中に濃縮または枯渇したコンストラクトはヒットとして識別され、それらがターゲットとする遺伝子が識別されます。ヒットは、Dharmaconカタログコレクションから注文できる個別の構成要素を使用してさらに確認および調査できます。

プロモーター活性の強さは生物学的状況によって異なり、実験結果に影響を与える可能性がある

BD9673FC8FDB45F8A0B0C2126D87BE8A — Promoter activity varies across several human and rodent cell lines. Cells were plated at a density of 50,000 cells per well in a 24-well plate and transduced at MOI = 15 with SMARTvector Empty Vector Control Particles expressing TurboGFP. Promoter activity was assessed at 72 hours post-transduction by the fluorescence intensity of TurboGFP.

プロモーター活性は、ヒトおよびげっ歯類の細胞株間で異なります。細胞を24ウェルプレートにウェルあたり50,000細胞の密度でプレーティングし、TurboGFPを発現するSMARTvector Empty Vector Control ParticlesをMOI = 15で形質導入しました。プロモーター活性は、TurboGFPの蛍光強度によって形質導入の72時間後に評価しました。