CRISPRmod CRISPRa synthetic crRNA（化学合成crRNA）

CRISPR activationを使用したヒトおよびマウス遺伝子の過剰発現のためのデザイン済み化学合成ガイドRNA。4種類のcrRNAの混合物（プール）または個別の試薬が利用可能です

ゲノムワイドのヒトおよびマウスの化学合成crRNA試薬は、CRISPRa用に特別に設計されています。dCas9-VPR発現と組み合わせ、強力なCRISPR-Cas9テクノロジーを利用して遺伝子を転写活性化することができます。

CRISPRmod CRISPRa synthetic crRNA（化学合成crRNA）

1Start Here

使いやすい化学合成試薬による内在性遺伝子活性化

CRISPR activation（CRISPRa）システムは、1つ以上の遺伝子転写活性化因子に融合した触媒活性が不活化されたCas9（dCas9）を利用するもので、古典的なCRISPR-Cas9ゲノム編集システムをユニークに改変したものです。プロモーター領域または転写開始部位（TSS: transcriptional start site）の上流の遺伝子配列を標的とする、適切に設計されたガイドRNAと組み合わせて使用すると、転写活性化を促進します。

テクノロジーの概要は、CRISPRaアプリケーションのページをご確認ください。

CRISPRa crRNA試薬のハイライト

配列デザインの異なる4種類のcrRNAの混合物（プール）または個別の試薬として利用可能で、非常に効果的な転写活性化を提供します（サポートデータを参照）。
Horlbeckらによって公開されたアルゴリズム²に基づいた設計です。最適化された設計による強力なレベルの遺伝子転写活性化を示しています（参考文献を参照）。
化学的に修飾されたcrRNAは、ヌクレアーゼ分解に対する安定性を高め、全体的なパフォーマンスを向上させます。
異なる転写開始部位を持つ遺伝子については、別個のガイドRNAデザインが利用可能です（P2とラベル付けされています）。

化学合成crRNAを用いたCRISPRa遺伝子転写活性化実験に必要な試薬：

dCas9-VPR³用のレンチウイルス発現用プラスミド、レンチウイルス粒子またはmRNA。dCas9-VPRは哺乳動物用にコドンを至適化したStreptococcus pyogenes由来dCas9にVPRを融合しています。SunTagテクノロジー⁴とも互換性があります。
化学合成tracrRNA（trans-activating CRISPR RNA）
標的遺伝子に対するデザイン済みCRISPRa crRNA

CRISPRa crRNAおよびtracrRNAの注文数量ガイドライン

この表は、プールフォーマットまたは個別のcrRNAのいずれかを用いて、推奨されるcrRNA:tracrRNA作業濃度（25 nM:25 nM）で、さまざまなプレート／ウェル形式でリピッドトランスフェクション法を実施できる概算の実験数を示しています。計算では、ピペッティングエラーは考慮されていません。

crRNA nmol	tracrRNA nmol	96-well plate 100 µL volume	24-well plate 500 µL volume	12-well plate 1000 µL volume	6-well plate 2500 µL volume
2	2	800	160	80	32
5	5	2000	400	200	80
10	10	4000	800	400	160
20	20	8000	1600	800	300

複数のdCas9-VPR安定発現細胞株における化学合成crRNA:tracrRNAによる効率的な遺伝子活性化

Efficient transcriptional gene activation

CRISPRa dCas9-VPRを安定発現するように改変されたHEK293T、U2OS、MCF 10A、NIH/3T3を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECTトランスフェクション試薬を使用して、POU5F1およびTTNを標的とするCRISPRa 化学合成crRNA:racrRNA（25 nM）をトランスフェクトしました。K562細胞には、POU5F1およびTTNを標的とするCRISPRa 化学合成crRNA:tracrRNA（400 nM）をエレクトロポレーションしました。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各遺伝子の相対的な転写活性化倍率は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。

CRISPRa 化学合成crRNAの混合物（プール）は転写活性化を高める

Pooling of synthetic crRNAs can enhance transcriptional activation

個別のCRISPRa crRNAは、それ自体でも強力な標的遺伝子の活性化を実現しますが、単一の試薬に一緒にプールすると、転写活性化レベルをより強くできます。CRISPRa dCas9-VPRを安定発現するように改変されたU2OS細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用してEGFRまたはPOU5F1を標的とするCRISPRa 化学合成crRNA:tracrRNAをトランスフェクトしました。4つのCRISPRaデザイン済みcrRNAは、個別またはプールフォーマットで使用しました（合計濃度：25 nM）。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各遺伝子の相対的な転写活性化倍率は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロール（NTC）に対して正規化しました。

CRISPRaによる転写活性化倍率は内在性遺伝子発現レベルに依存する

Fold activation by CRISPRa varies by gene

基礎発現が低いかまったくない遺伝子は、強力なレベルまで活性化するのが簡単ですが、すでに高レベルで発現している遺伝子は、さらに過剰発現するのがより困難です。dCas9-VPR安定発現U2OS細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して、異なる基礎発現レベルの23種類の遺伝子を標的とするCRISPRa 化学合成crRNA:tracrRNAプール（25 nM）をトランスフェクトしました。トランスフェクションから72時間後に細胞を回収し、相対的な遺伝子発現を、RT-qPCRを使用して測定しました。CRISPRaを介した転写活性化の倍数は上のグラフに示しました。ここでは、NTCコントロールで処理されたサンプルにおける基本的な転写産物の発現レベルが低いものから高いものへと遺伝子が並べられています。下のグラフには、GAPDHコントロールと比較した標的遺伝子の基礎発現を示しています。

蛍光抗体分析は、化学合成crRNAを使用した効果的なCRISPRa遺伝子の活性化を示す

Immunofluorescence analysis indicates effective CRISPRa gene activation using synthetic crRNA

dCas9-VPR安定発U2OS細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬（0.2 µL／ウェル）を使用して、TFAP2C、EGFR、IL1R2、POU5F1をターゲットとするCRISPRa化学合成crRNA:tracrRNAプール（総濃度25 nM）またはNTCコントロールをトランスフェクトしました。トランスフェクションの72時間後、細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、0.5％ Triton X-100で透過処理した後、ターゲット特異的一次抗体およびDylight 550標識二次抗体とインキュベートしました。核はHoescht33342で染色しています。標的特異的なCRISPRa crRNAプールフォーマットまたはNTCコントロールで処理された細胞について、蛍光画像を重ね合わせて示しています。

U2OS細胞におけるCRISPRaによる遺伝子の転写活性化は24時間で観察され、48〜72時間でピークに達する

CRISPRa gene activation in U2OS cells is observed at 24 hours

dCas9-VPR安定発現U2OS細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して、EGFR、IL1R2、POU5F1、またはTFAP2Cを標的とするCRISPRa化学合成crRNA:tracrRNAをトランスフェクトしました。４つのCRISPRaデザイン済みcrRNAは、個別またはプールフォーマットで使用しました（合計濃度：25 nM）。トランスフェクションの24、48、72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。

CRISPRa用量曲線は、25 nMの作業濃度で非常に効果的な遺伝子活性化を示す

CRISPRa crRNAs and pools are highly effective at 25 nM

dCas9-VPR安定発現U2OS細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して、EGFRまたはPOU5F1を標的とするCRISPRa化学合成crRNA:tracrRNAをトランスフェクトしました。デザイン済みcrRNAは、個別、または4つの濃度（1、5、25、100 nM）のプールフォーマットで使用しました。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を計算しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロールに対して正規化しました。