化学合成sgRNAとdCas9-SALL1-SDS3 mRNAを使用したCRISPRiワークフロー

細細胞をCRISPRi化学合成sgRNAおよびCRISPRi dCas9-SALL1-SDS3 mRNAでコトランスフェクトまたはエレクトロポレートします。次に、蛍光またはピューロマイシン耐性オプションを使用して細胞集団を濃縮します。このシステムは、迅速で一過性の遺伝子転写抑制研究に最適です。

dCas9-SALL1-SDS3と化学合成sgRNAによる堅牢な一過性の遺伝子転写抑制

K562およびJurkat細胞に、Lonza 96ウェルシャトルシステムを用いて、dCas9-KRABまたはdCas9-SALL1-SDS3 mRNA（2 µg）、および、PPIBあるいはSEL1LをターゲットとするプールフォーマットCRISPRi synthetic sgRNA（化学合成sgRNA）（5 µM）を導入ました。WTC-11 hiPS細胞に、Lonza 96ウェルシャトルシステムを用いて、dCas9-KRABまたはdCas9-SALL1-SDS3 mRNA（1 µg）、および、PPPIBまたはSEL1LをターゲットとするプールフォーマットCRISPRi synthetic sgRNA（3 µM）を導入しました。72時間後に細胞を回収しました。全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各標的遺伝子の相対的な遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いた∆∆Cq法で計算し、non-targetingコントロール（NTC）に対して正規化しました。

dCas9-SALL1-SDS3 mRNAとCRISPRi化学合成sgRNAの同時トランスフェクションは、安定したdCas9-SALL1-SDS3発現細胞株へのトランスフェクションよりも大きな遺伝子転写抑制をもたらす

データは解析タイミングと導入方法を合わせて、複数の実験から編集されたものです。dCas9-SALL1-SDS3を安定発現するU2OS細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用してSEL1Lを標的とするCRISPRi synthetic sgRNA（化学合成sgRNA）（25 nM）でトランスフェクトし、親U2OS細胞は、10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECT Duoトランスフェクション試薬を使用して、dCas9-SALL1-SDS3 mRNA（200 ng）およびSEL1Lを標的とするCRISPRi synthetic sgRNA（25 nM）をコトランスフェクトしました。dCas9-SALL1-SDS3を安定発現するJurkat細胞に、SEL1Lを標的とするCRISPRi synthetic sgRNA（5 µM）を導入し、親Jurkats細胞にはdCas9-SALL1-SDS3 mRNA（2 µg）およびSEL1Lを標的とするCRISPRi synthetic sgRNA（5 µM）をLonza 96ウェルシャトルシステムを用いて導入しました。dCas9-SALL1-SDS3を安定発現するWTC-11ヒトiPS細胞にSEL1Lを標的とするCRISPRi synthetic sgRNA（3 µM）を導入し、親のWTC-11hiPS細胞には、dCas9-SALL1-SDS3 mRNA（1 µg）およびSEL1Lを標的とするCRISPRi synthetic sgRNA（3 µM）をLonza 96ウェルシャトルシステムを用いて導入しました。U2OS細胞はトランスフェクションの48時間後に回収し、JurkatおよびhiPS細胞は導入72時間後に回収しました。全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。SEL1Lの相対的な遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHまたはACTBを用いたΔΔCq法で計算し、non-targetingコントロール（NTC）に対して正規化しました。

PuroRを共発現するdCas9-SALL1-SDS3mRNAは、ピューロマイシン選択を使用した濃縮を可能にする

K562細胞に、Lonza 96ウェルシャトルシステムを用いて、Puro dCas9-SALL1-SDS3 mRNA（2 µg）および、PPIB、CD46、PSMD7あるいはSEL1LをターゲットとするプールフォーマットのCRISPRi sgRNAを導入しました。導入24時間後に、2 µg/mlのピューロマイシンを含む増殖培地を細胞に添加し、複製プレートに通常の増殖培地を投与しました。ヌクレオフェクションの48時間後に全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各標的遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いたΔΔCq法で計算し、non-targeting（NTC）に対して正規化しました。

EGFPを共発現するCRISPRi dCas9-SALL1-SDS3 mRNAにより、FACSの濃縮が可能

HCT-116細胞を透明な6ウェルプレートに400,000細胞／ウェルで播種しました。 24時間後、DharmaFECT Duoトランスフェクション試薬を使用して、細胞にEGFP-dCas9-KRABまたはEGFP dCas9-SALL1-SDS3 mRNA（2.5 µg）、および、PPIB、PSMD7、またはSEL1L（25 nM）をターゲットとするプールフォーマットのCRISPRi synthetic sgRNA（化学合成sgRNA）をコトランスフェクトしました。トランスフェクションの24時間後に細胞をトリプシン処理し、FACSで細胞をGFP陰性（GFP Neg）と上位10％GFP発現（上位10％）の2つのカテゴリーに分類しました。選別後、細胞を6ウェルディッシュに再播種し、回復培養しました。回復培養の24時間後に細胞を回収し、全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各標的遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いたΔΔCq法で計算し、non-targetingコントロール（NTC）に対して正規化しました。