CRISPRmod CRISPRi all-in-one lentiviral sgRNA 全ゲノムプール化ライブラリー

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CRISPRmod CRISPRi all-in-one lentiviral sgRNA 全ゲノムプール化ライブラリー

CRISPRi all-in-oneプール化レンチウイルスライブラリーを用いて、転写レベルで数千の遺伝子を抑制することができます。

all-in-oneフォーマットのCRISPRmod CRISPRiライブラリーは、高い遺伝子転写抑制効果により、効率的な全ゲノムスクリーニングを実現し、遺伝子研究や治療法の発見を促進します。

CRISPRmod CRISPRiシステムは、CRISPRi sgRNAと転写抑制因子SALL1-SDS3が融合した、切断活性が不活化されたCas9（dCAS9）の2つのコンポーネントを必要とします。

dCas9-SALL1-SDS3は、一般的に使用されているdCas9-KRABシステムよりも、ゲノム全体にわたってよりロバストで一貫した遺伝子抑制を実現するために開発されました。

プロモーター（mCMVおよびhEF1α）の選択により、目的の細胞における最適なdCas9-SALL1-SDS3発現が可能になります。

CRISPRmod CRISPRiガイドRNAデザインは、公開されているCRISPRi v2アルゴリズム（Horlbeck et al 2016）を使用して設計されています。CRISPRiガイドRNAは、標的遺伝子の転写開始点（TSS）のすぐ下流の遺伝子配列に結合して転写を抑制します。

CRISPRmod CRISPRi all-in-one lentiviralベクターマップ

Schematic map of the CRISPRmod CRISPRi All-in-one lentiviral vector

Highlights:

dCas9-SALL1-SDS3および遺伝子特異的sgRNA抑制の両方に単一のレンチウイルスベクターを使用する効率的なall-in-oneベクターシステム
効率的かつ特異的な遺伝子抑制をもたらす合理的に設計されたレンチウイルスsgRNA
ヒトゲノム全体にわたり、1遺伝子あたり4または8個のsgRNAで深く広いカバレッジを実現し、ヒットの信頼性を向上
生物学的に関連性のある細胞タイプでロバストな不活性化を行うための複数のプロモーターオプション
最小限の細胞毒性で直接導入するために濃縮、精製された高品質の ≥ 2 × 10⁷ TU/mL（± 20%）レンチウイルス粒子

各CRISPRmod CRISPRi all-in-one lentiviral pooled screening libraryには、次のものが含まれています：

≥ 2 × 10⁷ TU/mL（± 20%）レンチウイルス粒子、10 × 100 uLアリコート、mCMVまたはhEF1αプロモーターオプション付き
ヒトゲノムのどの遺伝子ともアライメントしない（標的化しない）ことがバイオインフォマティックに確認された最大100個のnon-targeting gRNAネガティブコントロール
遺伝子アノテーション、sgRNAターゲット配列、完全なコントロールリスト、数百万マップリードあたりのカウントを含む完全なライブラリー情報を含むデータファイル

当社の検証済みプロトコールで推奨されている製品：

トランスダクションの最適化とプロモーター選択のためのベクター対応CRISPRi EGFPデリバリーコントロール
NGS Hit Identification primers （mCMVまたはhEF1α ベクター用）：

バイアスを最小限に抑えたゲノムDNAの効率的なPCR増幅
NGSランに多様性をもたらすスタッガードフォワードプライマー
部分的なIllumina®互換TruSeq®アダプターの追加

Edit-R Lentiviral sgRNA プールライブラリーのカバレッジに関する情報

遺伝子数およびコンストラクト数は予告なく変更される場合があります。クローン数および遺伝子数はご要望に応じてご提供いたします。Scientific Supportへお問い合わせください。

全ゲノムスクリーニングに必要なレンチウイルス粒子の量

実験細胞がHEK293Tと同じ相対形質導入効率を持つと仮定した場合、表示された倍数表現、生物学的複製、およびsgRNA/遺伝子におけるHEK293T細胞における2×107 TU/mLのレンチウイルス粒子の必要量。スクリーニングに必要なレンチウイルス粒子の量は、CRISPR pooled screening protocol tracking worksheetを使用して計算できます。
Fold representation	Replicates	sgRNAs per gene	Volume of lentiviral particles
200	2	4	1.7 mL
200	2	8	3.3 mL
400	2	4	3.3 mL
400	2	8	6.6 mL

NGS Library Prep Kit Contents	Small: 12 Whole Genome Screens	Large: 24 Whole Genome Screens
NEXTFLEX® PCR Master Mix (green cap)	3600 μL	7200 μL
Dharmacon HIT Identification Primers (orange cap)	300 μL	600 μL
NEXTFLEX® PCR II Barcoded Primer Mix	4 μL	4 μL
Resuspension Buffer	12 mL	24 mL
Nuclease-free water	8 mL	16 mL
Cleanup Beads	7 mL	15 mL

CRISPRmod CRISPRi all-in-one lentiviral プール化ライブラリーを用いた遺伝子抑制スクリーニングのワークフロー

細胞にCRISPRmod CRISPRi all-in-one lentiviral プール化ライブラリーを低い多重感染度（MOI）で形質導入した後にピューロマイシンで選抜します。形質導入された細胞は、選択圧および／または表現型選択を適用するために対照集団と実験集団に分けます。次に、形質導入を行った実験細胞集団と対照細胞集団からゲノム DNA を単離して、ゲノムDNA 内の sgRNA コンストラクトをベクター特異的 NGS Hit Identification Primer を用いて増幅します。アンプリコンは、市販のIllumina TruSeq®プレップキットを用いて、Illuminaのプラットフォーム上でハイスループットシーケンス用にインデックス化および調製できます。対照サンプルと実験サンプルの両方に統合されたsgRNA配列を同定し、相対的な存在量を比較します。濃縮または枯渇したsgRNAコンストラクトがヒットとして同定され、個別のCRISPRmod CRISPRi all-in-one lentiviral sgRNAを用いて追加の表現型および／または生化学的アッセイでさらに確認および研究することができます。

all-in-one lentiviral プール化ライブラリーを用いた一次スクリーニングのタイムライン

高品質のプール化スクリーニングは、厳格なレンチウイルスプールライブラリーの作製から始まる

高品質のプール化スクリーニングは、厳格なレンチウイルスプールライブラリーの作製から始まります。遺伝子あたり4つのレンチウイルスsgRNAからなるCRISPRmod CRISPRi Human all-in-one Lentiviral Whole Genome Pooled Libraryを作製し、次世代シーケンス（NGS）によりプラスミドDNAライブラリーの品質を検証しました。マップされた100万リードあたりのカウント数から、インプットsgRNAの回収率（98.2%）と、プール中の90%と70%のsgRNAの分布がそれぞれ11.2倍と3.7倍の範囲内であることがわかりました。

適合した蛍光デリバリーコントロールによりスクリーニング前の迅速な機能力価の確認と最適なプロモーターの選択が可能

適合した蛍光デリバリーコントロールにより、スクリーニング前に迅速な機能的力価の確認と最適なプロモーターの選択が可能です。DU145細胞（A）およびJurkat細胞（B）に、HEK293細胞における機能的力価単位（TU）を持つCRISPRmod CRISPRa all-in-one GFP delivery control mCMV（緑）およびhEF1α（紫）の5倍希釈系列を形質導入しました。導入後72時間にEGFP発現細胞の割合をフローサイトメトリーで定量しました。5～25％のEGFP発現細胞を示す希釈液は、目的の細胞株における相対的な機能力価および細胞株の相対的な導入効率を計算するために使用することができます。ある希釈度（5～25％のEGFP発現細胞を示す）におけるEGFP発現細胞の割合または平均蛍光強度を用いて、細胞株におけるプロモーター活性を比較することができます。どちらのプロモーターもJurkat細胞では同様の活性を示しますが、DU145細胞ではmCMVプロモーターの方がhEF1αプロモーターよりもかなり活性が高いことがわかります。

all-in-one dCas9-SALL1-SDS3 CRISPRiシステムによる必須遺伝子ドロップアウトの促進

A375 メラノーマ細胞において、CRISPRmod CRISPRi Human All-in-one lentiviral sgRNA全ゲノムプール化ライブラリー（濃い紫/緑）と、単一ベクター dCas9-KRAB全ゲノムプール化ライブラリー（薄い紫/薄い緑)）との比較による必須遺伝子のドロップアウトの促進を比較しました。スクリーニング終点における684のコア必須遺伝子（HART_CEGv2、紫）および非必須遺伝子（HART_NEG、緑）の公開セットのグループレベル解析を、T0と比較しました（Hart et al.）。非必須遺伝子を標的とするガイドは中立的な挙動を示す一方、必須遺伝子を標的とするガイドは、これらのガイドを発現する細胞が生存できないはずであるため、スクリーニング中にドロップアウトしました。

CRISPRmod all-in-one dCas9-SALL1-SDS3システムおよびdCas9-KRABシステムを使用して実施された全ゲノムCRISPRiスクリーニング間で、高い一致率でヒットが検出された

ベムラフェニブ（PLX-4032）で処理したA375メラノーマ細胞において、CRISPRmod CRISPRi Human All-in-one lentiviral sgRNA 全ゲノムプールライブラリー（A）または単一ベクターdCas9-KRAB全ゲノムプールライブラリー（B）を用いたスクリーニング間で、非常に一致性の高い耐性ヒットが検出されました。DrugZ スクリーニング分析による各遺伝子のlog2倍加濃縮と関連p値を示しています。有意に濃縮された遺伝子（正のLog2倍変化）は、薬剤治療に対する耐性を引き起こし、これらの遺伝子が薬剤の拮抗薬として作用する可能性を示しています。ハイライトされたヒットは、両方の技術で特定されました。