CRISPRmod CRISPRi synthetic sgRNA(化学合成sgRNA)ポジティブコントロール
遺伝子転写抑制実験の最適化のための検証済みのCRISPRi用化学合成プールフォーマットまたは個別のsgRNA
最適な実験条件を検討し、効率的な遺伝子転写抑制のためにdCas9-SALL1-SDS3の発現を確認するために使用します。
遺伝子転写抑制実験の最適化のための検証済みのCRISPRi用化学合成プールフォーマットまたは個別のsgRNA
CRISPRi synthetic sgRNA(化学合成sgRNA)ポジティブコントロールは、十分に特徴付けられたヒト遺伝子(PPIB1またはSEL1L)を選択的に転写抑制します。ポジティブコントロールは、標的遺伝子特異的なガイドRNAを用いた実験の前に、デリバリー条件とCRISPRi dCas9-SALL1-SDS3発現の最適化と継続的なモニタリングに推奨されます。
ポジティブコントロールに加えて、CRISPRi synthetic sgRNA(化学合成sgRNA) non-targetingコントロールを使用して、遺伝子発現のベースラインレベルを決定することをお薦めします。
個別のCRISPRmod CRISPRi sgRNAは、独立して強力な標的遺伝子抑制を達成しますが、プールすると抑制レベルが向上します。dCas9-SALL1-SDS3を安定して発現するU2OS細胞を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して、BRCA1、PSMD7、SEL1L、またはST3GAL4を標的とする化学合成sgRNAをトランスフェクトしました。デザイン済みsgRNAは、個別に使用、またはプールフォーマットを使用しました(合計濃度:25 nM)。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いた∆∆ Cq法で計算し、non-targetingコントロール(NTC)に対して正規化しました。