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Pin-point™塩基編集mRNA
Pin-point™塩基編集mRNAシステムは、二本鎖切断を誘発することなく、また相同組換え修復を必要とすることなく、正確に指向性のある点突然変異の編集を可能にします。
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Pin-point™塩基編集mRNAは、ニッカーゼCas9のDNAターゲティング能力とシチジンデアミナーゼのDNA編集活性を利用し、Pin-point化学合成sgRNAと組み合わせて使用することで、標的点突然変異を導入します。このプラットフォームは、哺乳類のコドンに最適化されたnCas9の翻訳用mRNAと、アプタマー結合タンパク質と融合した哺乳類のコドンに最適化されたデアミナーゼの翻訳用mRNAから構成されます。 Pin-point nCas9 mRNA Pin-point nCas9 mRNAは、UGIに融合した、5'および3'核局在シグナル（NLS）を有するS. pyogenesニッカーゼCas9（D10A）のヒトコドン最適化バージョンをコードします。nCas9 mRNAはin vitro転写され、CleanCap AGを用いてキャップされ、ポリアデニル化されています。翻訳後にタンパク質は核に局在化します。 Pin-point Rat APOBEC mRNA Pin-point Rat APOBEC mRNAは、アプタマー結合タンパク質と融合した5'NLSを有するシチジンデアミナーゼ塩基編集酵素のヒトのコドン最適化バージョンをコードします。Rat APOBEC mRNAはin vitroで転写され、CleanCap AGを用いてキャップされ、ポリアデニル化されています。翻訳後にタンパク質は核に局在化します。 |
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Pin-pointプラットフォームによる塩基編集は、DNAの二本鎖切断やインデル（indel）を形成することなく、特異的なヌクレオチド変化を誘導します。
このシステムは3つのコンポーネントから構成されています：
[1] DNAの一本鎖のみを切断または「ニッキング」するウラシルグリコシラーゼ（UGI）阻害剤と融合したヌクレアーゼ欠損「ニッカーゼ」nCas9（Komor, 2016）
[2]アプタマー結合タンパク質と融合したシチジンデアミナーゼ塩基編集酵素（Rat APOBEC）。シチジンデアミナーゼ酵素は、塩基対が編集ウィンドウ（プロトスペーサーのPAM遠位端の4から8位）内にある場合、C-G塩基対をT-A塩基対に変換します（Collantes, 2021）。
[3] nCas9とアプタマー：デアミナーゼ融合体を特定のDNA標的部位に誘導するアプタマー性シングルガイドRNA（sgRNA）。
哺乳類細胞に3つの構成要素すべてを導入することで、標的部位のC-GからT-Aへの塩基変換が誘導されます。このシステムは、遺伝子ノックアウト（未成熟終止コドンの導入（Billon, 2017）、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位の破壊（Webber, 2019））、または点突然変異の導入に使用できます。
Pin-point塩基編集システムの概要図
nCas9（薄い灰色）を利用することで、DNAの二本鎖切断が起こらず、DNA損傷応答経路がトリガーされません。Pin-point sgRNAにはアプタマー（緑）が含まれており、アプタマー結合タンパク質（オレンジ）を介してデアミナーゼ（青）をリクルートし、塩基編集を行います。
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