Pin-point™塩基編集mRNA

Pin-point™塩基編集mRNAシステムは、二本鎖切断を誘発することなく、また相同組換え修復を必要とすることなく、正確に指向性のある点突然変異の編集を可能にします。

Pin-point™塩基編集mRNAは、ニッカーゼCas9のDNAターゲティング能力とシチジンデアミナーゼのDNA編集活性を利用し、Pin-point化学合成sgRNAと組み合わせて使用することで、標的点突然変異を導入します。このプラットフォームは、哺乳類のコドンに最適化されたnCas9の翻訳用mRNAと、アプタマー結合タンパク質と融合した哺乳類のコドンに最適化されたデアミナーゼの翻訳用mRNAから構成されます。

Pin-point nCas9 mRNA

Pin-point nCas9 mRNAは、UGIに融合した、5'および3'核局在シグナル（NLS）を有するS. pyogenesニッカーゼCas9（D10A）のヒトコドン最適化バージョンをコードします。nCas9 mRNAはin vitro転写され、CleanCap AGを用いてキャップされ、ポリアデニル化されています。翻訳後にタンパク質は核に局在化します。

Pin-point Rat APOBEC mRNA

Pin-point Rat APOBEC mRNAは、アプタマー結合タンパク質と融合した5'NLSを有するシチジンデアミナーゼ塩基編集酵素のヒトのコドン最適化バージョンをコードします。Rat APOBEC mRNAはin vitroで転写され、CleanCap AGを用いてキャップされ、ポリアデニル化されています。翻訳後にタンパク質は核に局在化します。

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Modified or unmodified, which one should I use?

Both Pin-point nCas9 mRNA and Pin-point Rat APOBEC mRNA come in either unmodified or fully substituted with 5-methoxy-uridine (5moU modified) formats for optimized usage in different cell types. Additionally, each experiment with the Pin-point base editing system requires usage of nCas9 and Rat APOBEC mRNAs in combination with Pin-point synthetic sgRNA. View the "Ordering information" tab to find a table of the suggested use of the Pin-point mRNA formulations by cell type. Read our application note that discusses specific use cases for selecting unmodified versus 5moU modified mRNAs.

Pin-pointプラットフォームによる塩基編集は、DNAの二本鎖切断やインデル（indel）を形成することなく、特異的なヌクレオチド変化を誘導します。

このシステムは3つのコンポーネントから構成されています：

[1] DNAの一本鎖のみを切断または「ニッキング」するウラシルグリコシラーゼ（UGI）阻害剤と融合したヌクレアーゼ欠損「ニッカーゼ」nCas9（Komor, 2016）
[2]アプタマー結合タンパク質と融合したシチジンデアミナーゼ塩基編集酵素（Rat APOBEC）。シチジンデアミナーゼ酵素は、塩基対が編集ウィンドウ（プロトスペーサーのPAM遠位端の4から8位）内にある場合、C-G塩基対をT-A塩基対に変換します（Collantes, 2021）。
[3] nCas9とアプタマー：デアミナーゼ融合体を特定のDNA標的部位に誘導するアプタマー性シングルガイドRNA（sgRNA）。

哺乳類細胞に3つの構成要素すべてを導入することで、標的部位のC-GからT-Aへの塩基変換が誘導されます。このシステムは、遺伝子ノックアウト（未成熟終止コドンの導入（Billon, 2017）、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位の破壊（Webber, 2019））、または点突然変異の導入に使用できます。

Illustration of Pin-point base editing system

Pin-point塩基編集システムの概要図
nCas9（薄い灰色）を利用することで、DNAの二本鎖切断が起こらず、DNA損傷応答経路がトリガーされません。Pin-point sgRNAにはアプタマー（緑）が含まれており、アプタマー結合タンパク質（オレンジ）を介してデアミナーゼ（青）をリクルートし、塩基編集を行います。

TriLink BioTechnologies LLCはCleanCap®技術の所有者です。「CleanCap®」、「TriLink®」、「TriLink Biotechnologies®」は TriLink BioTechnologies LLC の登録商標です。

Table 1: Should I select Pin-point unmodified or Pin-point 5moU modified mRNAs?

*Note: Suggested use is based on optimized functionality when delivering Pin-point mRNAs as outlined in the Technical Manual and Quick protocols found in the Resources tab. Use of these mRNAs in additional cell types and/or with alternative workflows could result in different results. Read our application note that discusses specific use cases for selecting unmodified versus 5moU modified mRNAs.
Suggested use of Pin-point mRNAs by cell type
HEK293T cells	unmodified
Primary human T cells	unmodified
Induced pluripotent stem cells (iPSCs)	unmodified
Hemopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs)	5moU modified

Table 2　Pin-point mRNA必要量

* Note：最適な結果を得るためには、各試薬の正確な量を、実験セットアップ、細胞タイプ、細胞数、プレートフォーマットごとに最適化する必要があります。
	ウェル／フォーマットサイズごとの反応数*
	HEK 293T細胞（96ウェルプレートで50,000細胞／ウェル）		T細胞（24ウェルプレートで250,000細胞／ウェル）
	Pin-point nCas9 mRNA	Pin-point Rat APOBEC mRNA	Pin-point nCas9 mRNA	Pin-point Rat APOBEC mRNA
	1 µg/well	0.1 µg/well	1.56 µg/well	0.22 µg/well
20 µg	20	200	12	90
100 µg	100	1000	64	450
500 µg	500	5000	320	2252

Table 3　Pin-point sgRNA必要量

* Note：最適な結果を得るためには、各試薬の正確な量を、実験セットアップ、細胞タイプ、細胞数、プレートフォーマットごとに最適化する必要があります。
	ウェル／フォーマットサイズごとの反応数*
	HEK 293T細胞（96ウェルプレートで50,000細胞／ウェル）	T細胞（24ウェルプレートで250,000細胞／ウェル）
	60 pmol/well	Singleplex 20 pmol/well or Multiplex (3 guides) at 20 pmol/well each
2 nmol	33	100
5 nmol	83	250
10 nmol	166	500

Fig 1

初代ヒトT細胞におけるマルチプレックス塩基編集
Pin-point塩基編集プラットフォームは、多くの実験やT細胞ドナーにおいて効率的で再現性が良好です。活性化T細胞に、Pin-point mRNAと3つの標的（CD52、PDCD1、TRAC）に対するPin-point化学合成sgRNA、またはnon-targetingコントロール（NTC #1）sgRNAをエレクトロポレーションしました。Mockエレクトロポレーション（EP）細胞をネガティブコントロールとして使用しました。エレクトロポレーション後6～7日目に細胞を回収し、Pin-point解析用プライマーを用いてPCR産物のサンガー配列決定データから塩基編集レベルを算出しました。
T細胞ドナー（N = 8）、5つの独立した実験、二重または三重のテクニカルレプリケート。ヒゲは平均値 ± SD

Pin-point reagents supporting data Figure 2A

初代ヒトT細胞におけるマルチプレックス塩基編集の表現型解析
Pin-point塩基編集プラットフォームは、初代T細胞を効率的に多重遺伝子ノックアウトします。活性化T細胞に、3つの標的（CD52、PDCD1、TRAC）に対するPin-point mRNAおよびPin-point化学合成sgRNAをエレクトロポレーションし、7日後にフローサイトメトリーで解析しました。PD1の発現を誘導するために、T細胞は48時間前にPMA（phorbol 12- myristate 13-acetate）とイオノマイシンの存在下で培養しました。CD52とTCRa/bの発現は非刺激細胞を用いて分析しました。図は、編集サンプルおよびモックエレクトロポレーション（EP）サンプルの、生細胞における各マーカー陰性細胞の割合示しています。
T細胞ドナー（N = 2）の二重または三重のテクニカルレプリケート。ヒゲは平均値 ± SD

Pin-point reagents supporting data Figure 2B

初代ヒトT細胞におけるマルチプレックス塩基編集のフローサイトメトリープロット
編集サンプルとコントロールサンプルの、3つの各マーカーの代表的フローサイトメトリープロット。各マーカーの陰性細胞のゲーティングは生細胞で行われています。

Pin-point reagents supporting data Figure 2C

塩基編集によるトリプルノックアウトの編集効率
サンプル中の3つのマーカー（CD52、PD1、TCRa/b）が同時に陰性である細胞の割合。Pin-pointプラットフォームで編集したサンプル、およびモックエレクトロポレーション（EP）コントロールで、追加濃縮を行わず、生細胞における割合として示されています。PD1の発現を誘導するため、3つのマーカーを同時に定量できるように、分析前にT細胞をPMA（phorbol 12- myristate 13-acetate）とイオノマイシンの存在下で48時間培養しました。
T細胞ドナー（N = 2）、二重または三重のテクニカルレプリケート。ヒゲは平均値 ± SD

Pin-point reagents supporting data fig 2D

トリプルノックアウト塩基編集のフローサイトメトリーゲーティング戦略
編集サンプルの代表的フローサイトメトリープロットでゲーティング戦略を示しています。左より、生細胞でゲーティングされたCD52陰性集団、CD52陰性集団でゲーティングされたTCRa/b陰性集団、CD52とTCRa/b二重陰性集団でゲーティングされたPD1陰性集団。右端のゲートの細胞数は、3つのマーカーすべてが陰性細胞となります。トリプル陰性の細胞数は生細胞数で正規化し、上図にその割合を示しています。

3-days post electroporation

Figure 6
Representative editing and total cell count at 3 days post electroporation when delivering a Custom Pin-point Synthetic sgRNA targeting a chain of the major histocompatibility complex class 1 and either Pin-point unmodified or Pin-point 5moU modified mRNAs in T cells, iPSCs, and HSPCs.