Edit-R HDRプラスミドドナーコンポーネント
HDRプラスミド構築のためのインサートとバックボーン
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HDR経路を使用してEGFPまたはmKate2を挿入するためのEdit-R HDRプラスミドドナーキットは、ユニバーサルプラスミドバックボーン、DNAインサート、および2つのカスタム相同性アームから構成されています。任意のDNAを挿入するためのプラスミドドナーの組み立ても、インサート配列をユーザー提供のDNAフラグメントに置き換える以外は、同じ戦略を利用します。Edit-R HDRプラスミドドナーコンポーネントには、EGFPまたはmKate2インサートとプラスミドバックボーンのみが含まれます。
ドナープラスミドの使用と組み立てには、挿入部位を挟む5'および3' 相同性アームの増幅のための2つのプライマーペアの設計が必要です。これらのプライマーは、HDR Donor Designerを使用して設計およびご注文いただけます。
Highlights
- DNAドナープラスミドを迅速かつ効率的に組み立てます。
- ドナープラスミドの設計、組み立て、確認のための検証済みプロトコールをご用意しています。
- CRISPR Design Toolを利用して、切断部位へのcrRNAを設計できます。
- 挿入部位を挟む5 'および3'相同性アームを作成するためのプライマー設計用のHDR Donor Designerとシームレスに統合されています。
構成と容量
Catalog Number | Description | Item Number | Quantity |
---|---|---|---|
UK-008100-02-10 | Edit-R HDR Plasmid Donor & Insert - EGFP | ||
Edit-R HDR Plasmid Donor Backbone | U-008300-01-1200 | 1200 ng | |
Edit-R HDR insert - EGFP | U-008100-01-250 | 250 ng | |
UK-008200-04-10 | Edit-RHDR Plasmid Donor & Insert -mKate2 | ||
Edit-RHDR Plasmid Donor Backbone | U-008300-01-1200 | 1200 ng | |
Edit-RHDR Insert - mKate2 | U-008200-01-250 | 250 ng | |
U-008300-01-1200 | Edit-R HDR Plasmid Donor Backbone | U-008300-01-1200 | 1200 ng |
Note:バックボーンとEGFPまたはmKate2インサートは、Edit-R HDRプラスミドドナーキットに含まれています。バックボーンとEGFPまたはmKate2インサートのみをより多く必要な場合には、本Edit-R HDRプラスミドドナーコンポーネントをご注文ください。
U2OS細胞におけるEGFPでN末端にタグ付けされたLMNA
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U2OS細胞に、Cas9 mRNA、LMNAをターゲットとする化学合成crRNA:tracrRNA、および相同性アームあたり約1000 bpの相同性を含むLMNAのN末端に特異的なEGFPドナープラスミドを、DharmaFECT Duoを用いてトランスフェクトしました。必要に応じて細胞を継代し、トランスフェクションの7日後にInCell 2200ハイコンテント蛍光顕微鏡で画像化しました。
U2OS細胞におけるmKate2-SEC61B融合
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小胞体におけるタンパク質輸送の構成要素であるSEC61B遺伝子へのmKate2 N末端融合の作製。U2OS細胞に50 nM SEC61B-crRNA:tracrRNA、25 nM Cas9タンパク質、2 ng /μL SEC61Bm Kate2HDRドナープラスミドを、0.3 μL/ウェルDharmaFECT Duoをトランスフェクトし、トランスフェクションの7日後に蛍光顕微鏡で可視化しました。Note: Cas9タンパク質トランスフェクションのリボ核タンパク質(RNP)複合体比は2:1
HDRプラスミドドナーのクローニングに必要な材料
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Edit-R HDRプラスミドドナーは、蛍光タンパク質インサート配列、カットベクターバックボーン、挿入部位を挟むゲノム領域に対して設計したカスタムPCRプライマーを用いて生成された2つの相同性アームの組み立てによって作製されます。
Dharmacon Edit-R mKate2 knock-in donor
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Edit-R mKate2プラスミドドナーマップと重要なベクター機能。この図では、例として500 bpの相同性アームが含まれています。
プラスミドドナークローニングワークフロー
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コンポーネントの順序付け、相同性アームの増幅、およびプラスミドドナーの生成を含むプラスミドドナーのクローニングワークフロー。図の色は、DNAの由来を示しています(濃い青 = 5' 相同性アーム、水色 = 3' 相同性アーム、赤 = mKate2蛍光レポーター配列、オレンジ = プラスミドバックボーン)。medium alone = 培地のみのネガティブPCRコントロール
mKate2ノックインクローン細胞株を作製するためのワークフロー
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Kate2ノックインクローン細胞株を作製するために必要な主要なプロセスステップと一般的なタイミングを示すワークフロー