SMARTvector Lentiviral shRNA

遺伝子発現調節試薬
RNA干渉
shrna
SMARTvector Lentiviral shRNA

SMARTvector Lentiviral shRNA

目的の細胞で遺伝子ノックダウンを成功させるための情報に基づいた適切な製品選択を可能に

最先端のshRNAデザインによる遺伝子ノックダウンが保証され、複数のプロモーターおよびレポーターオプションが選択可能です。

SMARTvector Lentiviral shRNA

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SMARTvector Lentiviral shRNAは、ベクターベースのRNAi実験に最大限の柔軟性を提供します。shRNAを用いた遺伝子ノックダウンの効率は、shRNAの配列デザインやshRNAの発現を駆動・制御するプロモーター等に依存します。shRNAを使用した実験を計画する場合、実験の要件に基づいてそれらを選択できることが重要です。

SMARTvectorLentiviral shRNAは、最先端のmicroRNAベースのshRNA専用の合理的な設計アルゴリズムを使用して設計されており、非常に強力で特異的な配列が得られます。実験に使用する細胞と実験条件に合わせて7つのプロモーター^＊（hCMV, mCMV, hEF1α, mEF1α, CAG, PGK, UBC）、2つの蛍光レポーター（TurboGFPおよびTurboRFP）または蛍光レポーター非搭載タイプから選択できます。ヒト・マウス・ラットのほぼ全ての遺伝子について、最大10個のshRNAノックダウンコンストラクトをデザイン済みです。

フォーマットの選択が不明な場合は、SMARTchoice Platformをご確認ください。

^＊一部のプロモーターオプションは、カスタム製品として、またはリクエストに応じてのみ利用できる場合があります。

Highlights

SMARTvector Lentiviral shRNA

ヒト、マウス、ラットの遺伝子をターゲットにし、目的の細胞に合わせて複数のプロモーターオプションを選択できます。
遺伝子ノックダウン保証（Guaranteeタブを参照してください）
内在性RNAi経路を介して非常に効率的にプロセッシングされるmicroRNA scaffoldを採用して設計されています。
大腸菌グリセロールストックあるいは精製された濃縮レンチウイルス粒子をご用意しています。
1 x 10⁸ TU/mL ± 20％の標準力価、および2 x 10⁹ TU/mL ± 20％の超高力価をご用意しています。（力価はGFP陽性HEK293T細胞のFACS解析によって決定されています。）
初代細胞、神経細胞、幹細胞などのトランスフェクションが困難な細胞を含む、分裂および非分裂細胞タイプにも使用可能です。

これらの特性はレンチウイルスを介したRNAiの機能性と特異性を大幅に強化し、低力価の調製物（上清）に関連する毒性を低減します。

優れたDharmaconデザインアルゴリズムとmicroRNAベースshRNA

効率よくプロセッシングされる特許取得済みのmicroRNA scaffoldを利用しています。
合理的に設計された、効率の高い遺伝子ターゲティング配列です。
機能的ノックダウンテスト用に500以上の内在性mRNAデータポイントでトレーニングされたアルゴリズムでデザインされています。
オフターゲット遺伝子ノックダウンを低減するためのバイオインフォマティクス戦略を組み込んでいます。
タンパク質をコードする遺伝子はORFと3’UTRで標的とされます。Long non-coding RNAは、転写産物の全長にわたって標的とされます。

レンチウイルス粒子フォーマット

Dharmaconでは、高品質のレンチウイルス粒子製品の提供に取り組んでいます。そのため、厳密なQCコントロール下で、各コンストラクトをクローニング、パッケージ化、および濃縮しています。レンチウイルス粒子の生産と品質管理手順の固有の複雑さのため、製造期間は4〜6週間と推定されています。次の製品フォーマットを提供しています。

Set of 3：3つの異なる遺伝子ターゲティングコンストラクトのセット

同じ遺伝子を標的とする複数のshRNAを評価し、使用する細胞でのmRNAノックダウンをより確実にするために最適です。
100 µL (4 x 25 µL), 1 x 10⁸ TU/ mL ± 20％、または200 µL (8 x 25 µL), 1 x 10⁸ TU/mL ± 20％をご用意しています。（力価はGFP陽性HEK293T細胞のFACS解析によって決定されています。）

Individual：個々の遺伝子ターゲティングコンストラクト

最高のパフォーマンスを発揮するものとして決定した1～2つのコンストラクトの注文に最適です。
100 µL (4 x 25 µL), 1 x 10⁸ TU/ mL ± 20％、200 µL (8 x 25 µL), 1 x 10⁸ TU/mL ± 20％、または100 µL (4 x 25 µL), 1 x 10⁹ TU/mL ± 20％をご用意しています。（力価はGFP陽性HEK293T細胞のFACS解析によって決定されています。）

SMARTvector Lentiviral ポジティブおよびネガティブコントロール

遺伝子特異的な実験の前に、形質導入およびアッセイ条件を最適化します。
ネガティブコントロール粒子：シーケンス固有/非固有のノックダウン効果を区別できます。
ポジティブコントロール粒子：ハウスキーピング遺伝子を標的とする検証済みのshRNAコンストラクトを使用して、遺伝子ノックダウンを確認できます。
50 µL (2 x 25 µL), 1 x 10⁸ TU/ mL ± 20％、または100 µL (4 x 25 µL), 1 x 10⁹ TU/ mL ± 20％をご用意しています。（力価はGFP陽性HEK293T細胞のFACS解析によって決定されています。）
SMARTvectorコントロールについては、こちらからアクセスしてください。

SMARTvector Lentiviral shRNAベクターデザイン

Vector Element	Utility
5' LTR	5' Long Terminal Repeat necessary for lentiviral particle production and integration of the construct into the host cell genome
Ψ	Psi packaging sequence allows viral genome packaging using lentiviral packaging systems
P_RRE	Rev Response Element enhances titer by increasing packaging efficiency of full-length viral genomes
tGFP or tRFP	TurboGFP or TurboRFP reporter for visual tracking of expression
None	No-reporter option for use in applications where fluorescence is not required or desired
IRES	Internal Ribosomal Entry Site allows expression of fluorescent marker and puromycin resistance in a single transcript
Puro^R	Puromycin resistance permits antibioticselective pressure and propagation of stable integrants
SMARTvector universal scaffold	Optimized proprietary scaffold in which mature microRNA sequence is embedded
WPRE	Woodchuck Hepatitis Post-transcriptional Regulatory Element enhances transgene expression in target cells
3' SIN LTR	3' Self-inactivating Long Terminal Repeat for increased Lentiviral safety

内在性microRNAの機能は異なる

レンチウイルスサイレンシングコンストラクトへの、高度に機能的で適切にプロセッシングされたmicroRNA scaffoldの組み込みは、DNAベースのRNAiサイレンシングの機能を大幅に強化します。さまざまな内在性ヒトmicroRNAについて、それぞれのターゲットをサイレンシングする能力をHeLa細胞でテストしました。各microRNAは独特のレベルの機能を示します。いくつかのコンストラクト（例えば、miR-486および-526a）は低レベルの活性を示し、それぞれのレポーターコンストラクトを20％未満サイレンシングしましたが、ネイティブmiR-30および-374 scaffoldは中程度のレベルの遺伝子サイレンシングを提供します（〜50-70％, 上記を参照）。 SMARTvector Lentiviral shRNAのベースとして選択されたscaffoldは、それぞれのターゲットを効率的にプロセッシングし、80〜90％サイレンシングしました。この非常に機能的なmicroRNAは、RNAi発現プラットフォームで使用されている現在利用可能なmicroRNAベースのscaffoldを大幅に改善したものです。

内在性microRNAの成熟鎖とパッセンジャー鎖の機能は異なる

好ましいmicroRNA scaffoldは、パッセンジャー鎖に起因するオフターゲット効果が最小限に抑えられます。 Dharmaconチームは、プライマリスクリーンでテストされたいくつかのscaffoldのパッセンジャー鎖活性を調査しました。中程度に機能するmiR-30と高度に機能するmiR-126は、望ましくないパッセンジャー鎖活性を示します。対照的に、miR-SMARTvectorは、最小限のパッセンジャー鎖活性で強力な成熟鎖活性を示します。

microRNAベースshRNAとシンプルヘアピン型shRNAの比較

SMARTvector microRNAに適用したshRNAプラットフォームは、同じ遺伝子をターゲットとする単純なヘアピンshRNAよりも、かなり高い成熟鎖活性と低いパッセンジャー鎖活性を示します。最適化されたmicroRNAに適合したscaffoldの結果は、パッセンジャー鎖に起因するのオフターゲット効果のリスクを低減しながら、より高く、より特異的な機能になります。

2つの細胞株におけるSMARTvectorレンチウイルスshRNA粒子

2つの異なる細胞株に、CDK9、HIF1α、ILK、MAPK1、またはPTENを標的とするDharmacon SMARTvector Lentiviral shRNA粒子を3つのMOIで形質導入しました。QuantiGene branched DNAアッセイ（Panomics, Inc.）を使用して、形質導入の72時間後にmRNAノックダウンを評価し、SMARTvector Non-targetingコントロールに対して正規化しました。ほとんどの場合、ピューロマイシンの選択が無しに、70％以上の遺伝子ノックダウンが達成されました。合理的な設計、幅広い指向性、およびGFPレポーターの発現により、脂質を介した導入に抵抗性の細胞で効率的な遺伝子ノックダウンをもたらす形質導入の最適化が促進されます。

SMARTvectorレポーター非搭載タイプは、蛍光レポーターを備えたSMARTvectorコンストラクトと比較して同等の遺伝子ノックダウンを提示する

A549細胞株に、GAPDを標的とするDharmaconSMARTvectorレンチウイルスshRNA粒子（GFP蛍光レポーター有あるいは無し）を、さまざまなMOIで形質導入しました。 QuantiGene branched DNAアッセイ（Panomics、Inc。）を使用してピューロマイシン選択の5日後にmRNAノックダウンを評価し、対応するSMARTvector Non-targetingControlに対して正規化しました。すべての場合において、GAPDノックダウンは蛍光レポーターがある場合とない場合で同様です。

LentiBOOST Lentivirus Transduction Enhancer is a uniquely formulated transduction reagent that can be used with or without lentivirus spinfection in order to increase successful viral transduction events while preserving cell viability. Especially critical for preserving precious primary cells from patient cohorts, or, for engineering complex animal models; improving transduction efficiency can save time and costs by increasing the success of each editing/transduction step, or, even avoid the loss of irreplaceable samples. Additionally, LentiBOOST technology is already used in the manufacturing of a number of clinical stage therapies providing the opportunity to demonstrate improved workflow applicability to the clinic.

LentiBOOST can be purchased through the Dharmacon Reagents catalog.

To learn more about LentiBOOST technology visit the Revvity LentiBOOST webpage.

Supporting Data

Improved CD8+ T-cell SMARTvector™ shRNA lentiviral system transduction using LentiBOOST™ Lentivirus Transduction Enhancer

SMARTvector T-Cell Transduction with LentiBOOST

100,000 primary human CD8+ T cells were transduced with either 30,000 (MOI 3, green) or 70,000 (MOI 7, purple) TUs of SMARTVector™ mCMV tGFP Lentiviral Control Particles targeting either NTC or PPIB along with 1:100 LentiBOOST transduction enhancer. Cells were centrifuged at 800 x g for one hour at 32 °C followed by a four hour incubation prior to removal of lentiviral particles and transduction enhancer. Transduction efficiency (%GFP+ out of live cells) and viability were determined 5 days post-transduction by flow cytometry. The addition of LentiBOOST technology markedly improved transduction efficiencies without significantly impacting cell viability.

Improved CD4+ and CD8+ T-cell Edit-R™ All-in-one sgRNA/Cas9 lentiviral system transduction using LentiBOOST™ Lentivirus Transduction Enhancer

Edit-R T-Cell Transduction with LentiBOOST

100,000 primary human CD4+ and CD8+ T cells from two donors were transduced with 250,000 TUs of Edit-R GFP Delivery controls mCMV along with 1:100 LentiBOOST transduction enhancer. Cells were centrifuged at 800 x g for one hour at 32 °C followed by an overnight incubation prior to removal of lentiviral particles and transduction enhancer. Transduction efficiency and viability were determined 72 hours post-transduction by flow cytometry. The addition of LentiBOOST technology markedly improved transduction efficiencies without significantly impacting cell viability.

Improved transduction of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with the Strict-R™ Inducible CRISPRa lentiviral system transduction using LentiBOOST™ Lentivirus Transduction Enhancer

STRICT-R hiPSC Transduction with LentiBOOST

10,000 WTC hiPS cells were transduced with either 20,000 (MOI 2, green) or 40,000 (MOI 4, purple) TUs of Strict-R™ Inducible EGFP dCas9-VPR Lentiviral Particles along with 1:100 LentiBOOST transduction enhancer. Cells were centrifuged at 800 x g for one hour at 32 °C followed by an overnight incubation prior to removal of lentiviral particles and transduction enhancer. Transduction efficiency and viability were determined 72 hours post-transduction by flow cytometry. The addition of LentiBOOST markedly improved transduction efficiencies without significantly impacting cell viability.