Strict‑R Inducible CRISPRiレンチウイルスシステム

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Strict‑R Inducible CRISPRiレンチウイルスシステム

Dharmacon™ Strict‑R™ Inducible CRISPRiレンチウイルスシステムは、精密かつ調整可能な遺伝子抑制を可能にします。本システムは、卓越した特異性と最小限のバックグラウンド活性を維持しながら、厳密かつ可逆的な遺伝子サイレンシングを実現する、初のプラットフォームです。Tet‑On3GおよびFKBP12由来デグロンシステムの相乗的な組み合わせにより、低分子制御因子に応答したdCas9‑SALL1‑SDS3の誘導抑制および安定化が可能となり、標的遺伝子抑制を時間的に精密に制御できます。

精密な遺伝子抑制を可能にする二重誘導制御：仕組み

System OFF：誘導剤非存在下での厳密な制御
ドキシサイクリンおよびShield1が存在しない場合、本システムは不活性状態を維持します。TRE3Gプロモーターからの最小限の転写リークによってデグロンタグ付きdCas9‑SALL1‑SDS3が産生された場合でも、当該タンパク質は速やかにプロテアソーム分解を受けるため、バックグラウンド活性は最小限に抑えられます。

System ON：制御された強力な遺伝子サイレンシング
ドキシサイクリンを添加すると、TRE3Gプロモーターからの強力な転写が誘導されます。さらにShield1を同時に添加することで、デグロンタグ付きdCas9 SALL1 SDS3タンパク質が安定化され、遺伝子特異的sgRNAの存在下で、高効率かつ精密な標的遺伝子抑制が可能になります。

Highlights

低分子誘導による、可逆的かつ厳密な遺伝子発現抑制制御
dCas9‑SALL1‑SDS3融合タンパク質による、高効率な転写抑制と最小限のオフターゲット活性
ドキシサイクリンおよびShield1添加によりdCas9‑SALL1‑SDS3の誘導および安定化を可能にするTet‑デグロンシステムの統合
単一のレンチウイルスベクターによるデリバリーで、既存の実験ワークフローに容易に統合可能
遺伝子発現解析、機能ゲノミクス、スクリーニング用途に適した、高品質かつ精製済みレンチウイルス粒子（≥1×10⁷TU/mL）を提供し、細胞毒性を最小限に抑制
ハイグロマイシン選択、またはEGFP蛍光レポーターオプションに対応した柔軟な実験設計

Dharmacon Strict R Inducible CRISPRiレンチウイルスベクターの模式図

Schematic map of the Dharmacon™ Strict-R™ Inducible CRISPRi Lentiviral vectors

Dharmacon Strict‑R 誘導型 CRISPRi レンチウイルスシステムによる転写レベルおよび翻訳後レベルでの制御

Transcriptional and post-translational control with the Dharmacon™ Strict-R™ Inducible CRISPRi Lentiviral System

Dharmacon Strict R Inducible CRISPRiレンチウイルスシステムの模式図を示しています。ドキシサイクリンおよびShield1非存在下では、本システムは「OFF」状態となります。TRE3Gプロモーターからのリーキーな転写により、FKBP12由来の不安定化ドメイン（デグロン）と融合したdCas9 SALL1 SDS3が翻訳されますが、当該タンパク質は速やかにプロテアソーム分解を受けます。ドキシサイクリンの添加によりTRE3Gプロモーターからの強力な転写が誘導され、さらにShield1の添加によってdCas9 SALL1 SDS3タンパク質が安定化されます。これにより、遺伝子特異的sgRNAの存在下で、強力な標的遺伝子抑制が可能になります。本図はBioRender.comを用いて作成されています。

Dharmacon™ Strict-R™ Inducible CRISPRiレンチウイルスシステムは、複数の細胞株において強力な転写抑制と最小限のリーク性を示す

U2OS、K562、およびJurkat細胞に、Dharmacon™ Strict R™ Inducible CRISPRiレンチウイルスシステム（緑）または、各細胞株で最適化された構成的プロモーター（hEF1α、mCMV、hCMV）制御下でdCas9 SALL1 SDS3を発現する系（紫）を導入しました。これらの細胞に、PPIBまたはSEL1Lを標的とするCRISPRmod CRISPRiレンチウイルスsgRNA、または非標的コントロール（NTC）をMOI 0.3でトランスダクションしました。48時間後、2.5 µg/ mLピューロマイシンで5〜7日間選択を行いました。細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり20,000細胞で播種し、回収48時間前に0.5 µg/mLドキシサイクリンおよび500 nM Shield1で刺激しました。全RNAを抽出し、RT qPCRにより相対遺伝子発現量を測定しました。各遺伝子の相対発現量は、ACTBをハウスキーピング遺伝子としてΔΔCq法により算出し、NTCに対してノーマライゼ―ションしました。

Dharmacon™ Strict-R™ Inducible CRISPRiレンチウイルスシステムによるK562細胞における強力かつ可逆的な遺伝子抑制

Dharmacon™ Strict R™ Inducible CRISPRiレンチウイルスシステムを発現するK562細胞に、PPIBを標的とするCRISPRiレンチウイルスsgRNA、または非標的コントロール（NTC）をMOI 0.3でトランスダクションしました。48時間後、2.5 µg/ mLピューロマイシンで5日間選択を行いました。細胞を6ウェルプレートに1ウェルあたり200,000細胞で播種し、0.5 µg/mLドキシサイクリンおよび500 nM Shield1で刺激しました。低分子含有培地は48時間ごとに交換しました。初回刺激のみを行った群では、48時間後にPBSで洗浄し、その後は低分子非含有培地で培養しました。各時点で細胞を回収し、全RNAを抽出後、RT qPCRにより相対遺伝子発現量を測定しました。PPIBの相対発現量は、ACTBをハウスキーピング遺伝子としてΔΔCq法により算出し、NTCに対してノーマライゼ―ションしました。

Dharmacon™ Strict-R™ Inducible CRISPRiレンチウイルスシステムは、Shield1濃度を最大500nMまで増加させることで、より強力な遺伝子抑制を示す

Raising Shield1 concentrations up to 500 nM

Dharmacon™ Strict R™ Inducible CRISPRiレンチウイルスシステムを発現するU2OS細胞に、PPIBまたはSEL1Lを標的とするCRISPRiレンチウイルスsgRNA、または非標的コントロール（NTC）をMOI 0.3でトランスダクションしました。48時間後、2.5 µg/ mLピューロマイシンで5日間選択を行いました。細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり10,000細胞で播種し、0.5 µg/mLドキシサイクリンおよび各濃度のShield1を含む培地で刺激しました。48時間後に細胞を回収し、全RNAを抽出後、RT qPCRにより相対遺伝子発現量を測定しました。各遺伝子の相対発現量は、ACTBをハウスキーピング遺伝子としてΔΔCq法により算出し、NTCに対してノーマライゼ―ションしました。

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LentiBOOST™レンチウイルストランスダクションエンハンサーは、レンチウイルススピンフェクションの有無にかかわらず使用可能な独自処方のトランスダクション試薬です。細胞生存率を維持しながら、ウイルス導入効率を向上させることができます。患者由来の貴重な初代細胞や複雑な動物モデルの構築において特に有用であり、トランスダクション効率の向上により、各編集・導入ステップの成功率を高め、時間およびコスト削減につながります。また、LentiBOOST技術はすでに複数の臨床段階治療法の製造に使用されており、臨床応用を見据えたワークフローへの適用可能性を示しています。

LentiBOOSTはDharmacon試薬カタログから購入可能です。

LentiBOOST技術の詳細については、Revvity LentiBOOSTウェブページをご覧ください。

Supporting Data

LentiBOOST™ Lentivirus Transduction Enhancerを用いたCD8+ T細胞SMARTvector™ shRNAレンチウイルスシステムのトランスダクション効率向上

SMARTvector T-Cell Transduction with LentiBOOST

100,000個のヒト初代CD8+ T細胞に、NTCまたはPPIBを標的とするSMARTvector™ mCMV tGFPレンチウイルスコントロール粒子を、30,000 TU（MOI 3、緑）または70,000 TU（MOI 7、紫）で、1:100希釈のLentiBOOSTトランスダクションエンハンサーとともに導入しました。細胞は32 °C、800 x gで1時間遠心後、4時間培養し、その後レンチウイルス粒子およびトランスダクションエンハンサーを除去しました。トランスダクション効率（生細胞中のGFP陽性率）および細胞生存率は、トランスダクション5日後にフローサイトメトリーで評価しました。LentiBOOST技術の添加により、細胞生存率に大きな影響を与えることなく、トランスダクション効率が顕著に向上しました。

LentiBOOST™ Lentivirus Transduction Enhancerを用いたCD4+およびCD8+ T細胞Edit R™ All in one sgRNA/Cas9レンチウイルスシステムのトランスダクション効率向上

Edit-R T-Cell Transduction with LentiBOOST

2名のドナー由来の100,000個のヒト初代CD4+およびCD8+ T細胞に、Edit R GFP DeliveryコントロールmCMVを250,000 TUで、1:100希釈のLentiBOOSTトランスダクションエンハンサーとともに導入しました。細胞は32 °C、800 x gで1時間遠心後、一晩培養し、その後レンチウイルス粒子およびトランスダクションエンハンサーを除去しました。トランスダクション効率および細胞生存率は、トランスダクション72時間後にフローサイトメトリーで評価しました。LentiBOOST技術の添加により、細胞生存率に大きな影響を与えることなく、トランスダクション効率が顕著に向上しました。

LentiBOOST™ Lentivirus Transduction Enhancerを用いたStrict R™ Inducible CRISPRaレンチウイルスシステムによるヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）のトランスダクション効率向上

STRICT-R hiPSC Transduction with LentiBOOST

10,000個のWTC hiPSCに、Strict R™ Inducible EGFP dCas9 VPRレンチウイルス粒子を20,000 TU（MOI 2、緑）または40,000 TU（MOI 4、紫）で、1:100希釈のLentiBOOSTトランスダクションエンハンサーとともに導入しました。細胞は32 °C、800 x gで1時間遠心後、一晩培養し、その後レンチウイルス粒子およびトランスダクションエンハンサーを除去しました。トランスダクション効率および細胞生存率は、トランスダクション72時間後にフローサイトメトリーで評価しました。LentiBOOSTの添加により、細胞生存率に大きな影響を与えることなく、トランスダクション効率が顕著に向上しました。