CRISPRゲノム編集と siRNA を介した遺伝子ノックダウンを成功させるには、目的の細胞への試薬の効率的な取り込みが必要です。脂質ベースのトランスフェクション（Lipid mediated transfection）は、試薬を細胞に導入するための簡単かつ迅速な方法です。リバーストランスフェクションは、自動化とハイスループット スクリーニングのセットアップのための強力なツールです。ただし、実験を成功させるためには最適化された条件が必要です。ここでは、リバース トランスフェクション条件を最適化するための実験の設定方法について説明します。
現在使用されている主なトランスフェクションには、標準的なトランスフェクション（フォワードトランスフェクション）とリバーストランスフェクションの2つの方法があります。方法の主な違いは、3つの必要なコンポーネントを追加する順序です。フォワードトランスフェクションでは、0日目に細胞を播種し、約24時間後にトランスフェクション試薬を細胞に添加します。リバーストランスフェクションでは、トランスフェクション試薬を分注し、同じ日に細胞を試薬の上に播種します。リバース トランスフェクションはハンズオン時間を短縮し、簡単に自動化できるため、ハイスループット実験において有用です。ここでは、リバース トランスフェクション実験を最適化する方法に焦点を当て、96ウェル プレートをセットアップして 30の異なるトランスフェクション条件を一度にテストする方法を示します。
リバーストランスフェクションの最初のステップは、試薬プレートをセットアップすることです。最適化のために、2つの異なる播種濃度を使用することをお勧めします。プレートの左右に異なる濃度で播種し、同一条件で検討しました。
Figure 1.リバース トランスフェクション条件を最適化するためのプレート レイアウト
試薬量を最適化するために、3つの異なる濃度をテストすることをお勧めします。行う実験に応じて、siRNA、crRNA:tracr/Cas9複合体、または sgRNA/Cas9複合体の可能性があります。当社のすべての製品は、技術マニュアルで作業濃度を推奨しています。この推奨濃度は、さまざまな濃度をテストする際の適切な平均的な濃度です。
最後に、5つの異なる量のリピッドトランスフェクション試薬をテストすることをお勧めします。この例では、当社の DharmaFECTトランスフェクション試薬を使用しましたが、同様の戦略を別の脂質ベースのトランスフェクション試薬で使用することもできます。最適化範囲の中央を見つけるためのガイドとしてメーカーの推奨条件を使用します。オリゴがトランスフェクション試薬と複合体を形成した後、図に示すように、2つの異なる細胞濃度をマルチウェル プレートに播種します。試薬と細胞のインキュベーション時間は 24 時間から 120 時間で、細胞の種類と倍加速度によって異なります。最適な条件を特定するための迅速で簡単なフォローアップのために、各条件の成功を監視する蛍光色素を使うなどの堅牢な表現型アッセイをお勧めします。
詳細については、当社のリバース トランスフェクション プロトコール (siRNA / crRNA library)を参照してください。更に情報が必要な場合は、テクニカルサポート チームにお問い合わせください。
Written by: Ivonne Rubio, Ph.D. | Scientific Support Specialist 3
Ivonne has been part of the scientific support team since August 2013. With several additional years of hands on experience in the lab and a broad scientific background. She loves assisting customers with their scientific questions, especially about different strategies in gene modulation or CRISPR based studies.
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