特異性と機能性のためのガイドRNA設計についての考察
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CRISPRは、標的DNAを改変するためにRNAを用いた最初の方法でした。ジンクフィンガーヌクレアーゼやTALENとは異なり、特定の配列を標的とするためにタンパク質全体を再設計する必要はありません。S. pyogenes Cas9が、ゲノム全体において、NGG PAMモチーフに隣接する任意の20ヌクレオチド配列をターゲットにすることができます。これは、バクテリアがCRISPRシステムを使用してウイルス病原体の配列を切り出して保存する、つまり「記憶」するバクテリアの免疫システムの優雅さです。細菌系は、Cas9がNGG（任意のヌクレオチド、guanine, guanine）配列であるプロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif: PAM）を検索し、次にCRISPR RNA配列の標的領域を使用して隣接する20ヌクレオチドを標的とする単純なものです。 |
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ウェビナー：最も機能的で特異的なCRISPRノックアウトガイドRNAの設計
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哺乳動物細胞でこれを実装する場合、Cas9を使用してゲノムDNAを標的にして切断します。これにより、細胞が切断を不完全に修復し、配列にエラーを導入すると、コーディング遺伝子の翻訳が中断されます。遺伝子全体を調べて、すべてのNGG PAMを調べ、考えられるすべての部位を標的とするガイドRNAを作成する代わりに、どの配列が最も効率的に標的とし、結合、および切断するかを予測する必要があります。ゲノム編集実験の成功は、遺伝子の機能的破壊またはノックアウトによって測定されます。ノックアウトを確実にすることに加えて、切断が特異的であり、ゲノムの他の領域を破壊しないこと（オフターゲットが無いこと）を確認する必要があります。
強力なノックアウトと高い特異性を実現するCRISPR-Cas9 RNAガイドを設計するには、すべてのNGG PAMを調べるだけでなく、ガイダンスが必要である
設計するにあたり、次のような考慮事項が必要です。
- ガイドRNA配列の融解温度
- NGG PAMの最初の位置 － 可変ヌクレオチドが重要になる可能性があります。
- ジヌクレオチド含有量
- コーディングシーケンス（coding sequence: CDS）のカットの位置
偏りのないハイスループットな方法で、高度に機能的で具体的なガイドRNAを作成することに寄与するすべての相互依存要因のバランスを取ることは複雑です。CRISPR配列の選択は、非常に時間がかかる作業であり、研究している生物学から離れてしまう可能性があります。科学者がツールではなく生物学に集中できるように、当社がその作業を完了しています。
当社のRNAi製品ライン（ON-TARGETplus、 ACCELL、SMARTvector）の数十年にわたるアルゴリズム構築の経験を使用して、ノウハウを活用し、Dharmacon™ Edit-R™ アルゴリズムとしても知られるCRISPRガイドRNA設計のための包括的なルールセットを構築しました。最初に、10の遺伝子にわたる1,100を超えるガイドRNAの「テストセット」を合成しました。次に、得られた表現型に焦点を当ててアレイスクリーニング形式で機能性と特異性についてガイドRNAを分析し、高度に機能的で特異的なガイドRNA配列を予測するパラメーターを特定しました。次に、アルゴリズムの堅牢性を確認するために、in silico予測を複数の異なるアッセイとリードアウトで検証しました。
これらのガイドデザインルールは、すべてのデザイン済み製品に使用されます。当社のデザイン済みガイドRNAの使用により、試薬の検証に時間を費やす必要がなく、特定の生物学と関心のある遺伝子に集中できるため、ゲノム編集実験から研究目標を達成できます。
Dharmacon Edit-R CRISPRノックアウトアルゴリズムの開発方法について詳しくは、CRISPRジャーナルが主催するEmily Andersonの包括的なウェビナーをご覧ください。こちらからご視聴ください（登録が必要です）。