siRNAノックダウン保証

デザイン済みON-TARGETplus siRNA試薬（SMARTpool およびindividual siRNAの4つのうち3つ）について、mRNA発現レベルで最低75%の遺伝子発現抑制を保証します。機能保証の実験条件: トランスフェクション試薬を用いてsiRNAを100 nM濃度で細胞へトランスフェクションし、導入から24時間後および48時間後のmRNA発現レベルの解析結果をご提示いただきます。同時に、ノックダウンがバリデート済みの適切なHorizonポジティブコントロールsiRNAを用いて同一条件下で同時に実験を行っていただき、最適な条件で細胞にトランスフェクションされたこと、十分にsiRNAが機能していることを示すコントロール実験のデータが必須となります。ノックダウン効率は、標的遺伝子に対して用いたsiRNAと同じ種類のHorizonネガティブコントロールsiRNAを導入した細胞に対して定量RT-PCR法を用いて評価してください。

Note：ほとんどのON-TARGETplus siRNA製品は、5〜25 nMの作業濃度で高機能です。

ノックアウト実験のための適切なサポート試薬の選択

ON-TARGETplus siRNAコントロール

最適な特異性のために特許取得済みの修飾を施している検証済みのポジティブコントロールとnon-targetingネガティブコントロールです。プール（混合物）または個別のsiRNAとしてご用意しています。ON-TARGETplus control siRNAとプールは特許取得済みのON-TARGETplus修飾を用いて最適な特異性のために作製されました。オフターゲット効果が最小限に抑えられているため、siRNA実験のコントロールとして推奨されます。

複数種類のnon-targetingコントロールは、潜在的な非特異的効果の評価を可能にし、実験に使用する細胞と使用するアッセイに最適なネガティブコントロールとなります。プールされたsiRNAコントロールは、オフターゲットをさらに低減するために推奨され、また、標的遺伝子に対するSMARTpool siRNA試薬と共に使用することをお勧めします。

種特異的なポジティブコントロールを選択して、実験に使用する細胞で発現しているハウスキーピング遺伝子をノックダウンします。

トランスフェクション試薬

DharmaFECTトランスフェクション試薬は、デリバリーの改善と毒性の低減のために最適化されています。実験に最適なDharmaFECT試薬は、Cas9ヌクレアーゼの種類と細胞のタイプによって異なります。

注文数量ガイドライン

ON-TARGET plus試薬は、通常5〜25 nMの濃度で使用されます。以下の計算は、25 nMの場合の推定値であり、ピペッティングエラーは考慮されていません。

ON-TARGETplus修飾により、オフターゲットの総数が低減し、siRNAの混合により、オフターゲットがさらに減少する

パネル（A）および（B）は、（A）単一のsiRNAおよび（B）SMARTpool試薬にON-TARGETplus修飾を適用した場合と適用しない場合のオフターゲットシグネチャの代表的な例です。緑のバーは、図に示されたsiRNA試薬で処理した場合に発現が2倍以上減少した遺伝子を示します。ON-TARGETplus修飾は、修飾されていないsiRNAと比較してオフターゲットを低減させました。siRNAのプール化およびON-TARGETplus修飾の導入は、オフターゲット遺伝子ノックダウンの減少に、独立的に、あるいは共同して寄与します。パネル（C）は、10個の異なる遺伝子（遺伝子あたり4種類のsiRNAまたは4種類のsiRNAを1本のチューブに混合したSMARTpool試薬）を標的とする図に示されたsiRNA試薬によって誘導されるオフターゲット（2倍以上のダウンレギュレーション）の定量結果を表しています。オフターゲットは、マイクロアレイ分析（Agilent）を使用して定量化され、コンパイルされました。影付きの各ボックスは、データセットの中央の50％を表します。
ボックス内の水平線：データセットの中央値
縦棒：最小および最大のデータ値

オフターゲットによる偽の表現型は、ターゲット遺伝子のノックダウンが維持されたままで、ON-TARGETplus SMARTpool試薬によって低減される

細胞遊走に対するARPC1B遺伝子のノックダウンの効果を、乳がん細胞株で研究しました。細胞の単層を均一にこすり取り、こすり箇所を閉じる（創傷治癒）ための細胞遊走の速度を評価しました。未修飾およびON-TARGETplus siRNA試薬の両方を用いて、標的遺伝子の強力なノックダウンを誘導しました。未修飾の個々のsiRNAを細胞に導入した場合では、オフターゲット効果（赤い輪郭）による一貫性のない表現型が観察されました。未修飾のSMARTpoolは偽の表現型をかなりの程度まで改善しましたが、ON-TARGETplus SMARTpoolはオフターゲット効果を大幅に軽減し、一貫した表現型を生成しました。

Kaylene Simpson, Laura Selfors, and Joan Brugge, Harvard Medical Schoolとの共同研究

ON-TARGETplus修飾パターンのみがプレミアムサイレンシングのために両方のsiRNA鎖に対応する

ON-TARGETplus二本鎖化学修飾は、センス（パッセンジャー）鎖がRISCに取り込まれるのをブロックし、アンチセンス（ガイド）鎖のRISCへのローディングを促進することにより、まずセンス鎖によって誘発されるオフターゲットを低減します。しかしながら、siRNAオフターゲットの大部分は、ガイド鎖のシード領域によって駆動されます。ON-TARGETplus修飾はシード領域内に施され、miRNA様の活性を不安定にし、標的遺伝子に対する特異性を向上させます。

低頻度のシード領域を持つsiRNA配列の使用により、オフターゲットが少なくなる

ON-TARGETplus siRNAデザインは、高度なバイオインフォマティクスを活用して、高頻度または高度に保存されたmiRNAシード領域に起因するmiRNA様のオフターゲットの可能性を低減します。シード頻度が低いsiRNAは、中頻度または高頻度のシードを持つsiRNAよりもオフターゲットの数が大幅に少なくなります。低、中、または高頻度のシード領域を持つ5つのsiRNAをHeLa細胞にトランスフェクトし、それらに関連するオフターゲットシグネチャをグローバル発現プロファイリング（Agilent 22Kプラットフォーム）で評価しました。siRNA配列は1位と8-19位で一定であり、シード領域（2-7位）のみが変更されました。

低頻度シード：HeLaトランスクリプトームで350回未満

中頻度：2500〜2800回

高頻度：> 3800回

ON-TARGETplus siRNA二本鎖修飾パターンにより、オフターゲットが低減する

2006年の論文は、オフターゲット効果が主にアンチセンス鎖シード活性によって引き起こされることを示しています（Referenceタブ、参考文献2を参照）。したがって、センス鎖の不活性化だけでは、オフターゲット遺伝子の総数は減少しません。

ON-TARGETplusの修飾は、センス鎖・アンチセンス鎖両方の鎖に施されます。

• センス鎖は、RISCとの相互作用を防ぎ、アンチセンス鎖の取り込みを促進するように修飾されています。
• アンチセンス鎖シード領域は、シード関連のオフターゲットを最小限に抑えるように修飾されています。

ON-TARGETplusの修飾パターンは、オフターゲットを劇的に減らします。図に示されたsiRNAによって誘発されたオフターゲット効果を、マイクロアレイ分析を使用して定量化しました。各ターゲットに対して、3種類の異なるsiRNA（未修飾、センス鎖不活性化、およびON-TARGETplus修飾）を使用しました。示されているデータは、2倍以上ダウンレギュレーションされている遺伝子を表しています。HEK293細胞は、0.2μLのDharmaFECT 1を使用して100 nM siRNAでトランスフェクトしました。データは24時間分析しました。

1. A. L. Jackson et al., Position-specific chemical modification increases specificity of siRNA-mediated gene silencing. RNA. 12(7), 1197-1205 (July 2006).
2. A. Birmingham et al., 3'-UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nature Methods. 3(3), 199-204 (March 2006).
3. E. M. Andersonet al., Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity. RNA. 14(5), 853-861 (May 2008).