- CRISPRa (CRISPR activation) 試薬
- CRISPRa化学合成crRNA non-targetingコントロール
CRISPRmod CRISPRa synthetic crRNA(化学合成crRNA)non-targetingコントロール
CRISPRa synthetic crRNA(化学合成crRNA) non-targetingコントロールは、CRISPRa crRNAプールフォーマットまたは個別でご用意しており、遺伝子転写活性化実験のネガティブコントロールとして使用するために設計され、推奨されています。これらのnon-targetingコントロールは、tracrRNAとハイブリダイズし、dCas9-VPRと結合して複合体を形成しますが、ヒトまたはマウスゲノム内のPAM隣接部位を標的としません。ネガティブコントロールで処理された細胞で観察された遺伝子発現レベルまたは生存率の変化は、標的特異的CRISPRa化学合成crRNAのプールフォーマットまたは個別crRNAで処理された細胞と比較するための、CRISPRaコンポーネントに対する細胞のベースライン応答として使用できます。
Highlights
- ヒトまたはマウスのゲノム内の潜在的なターゲット配列に対して少なくとも3つのミスマッチまたはギャップを検証するために使用される独自のアラインメントツールを採用しています。
- 実験に使用するcrRNA試薬フォーマットに合わせて、プールフォーマットまたは個別crRNAコントロールを選択できます。
注意:CRISPRa化学合成crRNA試薬は、tracrRNAと組み合わせて用います。
crRNA nmol | tracrRNA nmol | 96-well plate 100 µL volume | 24-well plate 500 µL volume | 12-well plate 1000 µL volume | 6-well plate 2500 µL volume |
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2 | 2 | 800 | 160 | 80 | 32 |
5 | 5 | 2000 | 400 | 200 | 80 |
10 | 10 | 4000 | 800 | 400 | 160 |
20 | 20 | 8000 | 1600 | 800 | 300 |
dCas9-VPR安定発現細胞株を使用したCRISPRaワークフロー
Lentiviral dCas9-VPRと化学合成crRNA:racrRNA(左側)または lentiviral expressed sgRNA(右側)を使用したCRISPR activationワークフロー
化学合成crRNAの混合物(プール)は転写活性化を高める
個別のCRISPRa crRNAは、それ自体でも強力な標的遺伝子の活性化を実現しますが、単一の試薬に一緒にプールすると、転写活性化レベルをより強くできます。dCas9-VPRを安定発現するように改変されたU2OS細胞を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用してEGFRまたはPOU5F1を標的とする化学合成crRNA:tracrRNAをトランスフェクトしました。デザイン済みcrRNAは、個別またはプールフォーマットで使用しました(合計濃度:25 nM)。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各遺伝子の相対的な転写活性化倍率は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを使用するCq法で計算し、non-targetingコントロール(NTC)に対して正規化しました。