細胞をCRISPRi化学合成sgRNAおよびCRISPRi dCas9-SALL1-SDS3 mRNAでコトランスフェクトまたはエレクトロポレートします。次に、蛍光またはピューロマイシン耐性オプションを使用して細胞集団を濃縮します。このシステムは、迅速で一過性の遺伝子転写抑制研究に最適です。

dCas9-SALL1-SDS3レンチウイルス粒子で細胞を形質導入して、‘CRISPRi ready’ のdCas9-SALL1-SDS3安定発現細胞株を作製します。次に、ターゲット遺伝子に特異的なCRISPRi化学合成sgRNAを導入します。このシステムは、トランスフェクション可能な細胞モデルでのアレイ化スクリーニングに最適です。

CRISPRmod CRISPRi化学合成sgRNAは、dCas9-KRABおよびdCas9-SALL1-SDS3発現細胞の双方で、トランスフェクション後48〜72時間で最大の抑制を達成します。dCas9-KRABまたはdCas9-SALL1-SDS3を安定して発現するU2OS細胞を、10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して、CBX1、HBP1、またはSEL1Lを標的とするデザイン済みCRISPRi化学合成sgRNA（25nM）のプールフォーマットでトランスフェクトしました。トランスフェクションの24、48、72、96、120、および144時間後に細胞を回収し、全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各標的遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いた∆∆ Cq法で計算し、non-targetingコントロール（NTC）に対して正規化しました。

Figure 5. 個々のCRISPRmod CRISPRi sgRNAは、独立して強力な標的遺伝子抑制を達成しますが、一緒に混合（プール）して単一の試薬にすると、抑制レベルが向上します。dCas9-SALL1-SDS3を安定して発現するU2OS細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECT4トランスフェクション試薬を使用して、BRCA1、PSMD7、SEL1L、またはST3GAL4を標的とする化学合成sgRNAをトランスフェクトしました。デザイン済みsgRNAは、個別に使用、またはプールして使用しました（合計濃度は25 nM）。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いたΔΔCq法で計算し、non-targeting コントロール（NTC）に対して正規化しました。

Figure 7. CRISPRiの転写抑制は遺伝子によって異なりますが、内在性遺伝子の発現レベルに依存しているようには見えません。データは、dCas9-SALL1-SDS3を安定して発現するU2OS細胞において、以下のマッチング条件で実行された複数のトランスフェクションから編集されました。細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して、異なる基礎発現レベルの21個の遺伝子を標的とする化学合成sgRNAプール（25 nM）をトランスフェクトしました。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各標的遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いたΔΔCq法で計算し、non-targeting コントロール（NTC）に対して正規化しました。CRISPRiを介した標的遺伝子の抑制は、左グラフに示されています。ここでは、遺伝子が低レベルから高レベルの基本転写産物発現の順に並べられています。。右グラフでは、標的遺伝子の発現が、100万あたりの転写産物のキロベースあたりのフラグメント（FPKM）に対してプロットされています。これは、親U2OS細胞株からのRNA-Seqデータに基づく基本的な遺伝子発現の表現です。U2OS細胞では、PPIBはSOX2の約100倍の基礎レベルで発現しますが、両方の遺伝子はCRISPRmod CRISPRi試薬を使用して基礎的な発現の約20〜25％に抑制できます。