Cas9ヌクレアーゼ発現プラスミドとEdit-R 化学合成ガイドRNAを使用した遺伝子ノックアウトワークフロー

ゲノム編集に必要なEdit-R CRISPR-Cas9コンポーネント（Cas9ヌクレアーゼを発現するプラスミド、tracrRNA、目的の標的部に対して設計されたcrRNA）の図:
遺伝子破壊を行うために、DharmaFECT Duoトランスフェクション試薬を使用して、選択した哺乳類細胞に3つのコンポーネントのすべてをコトランスフェクトします。トランスフェクトされた細胞の濃縮は、蛍光細胞選別またはピューロマイシン耐性の選択によって行うことができます。

Less time preparing, more time experimenting

Edit-R Gene Engineeringシステムは、高品質の化学合成tracrRNAとcrRNAを用いてCas9ヌクレアーゼをプログラムするため、個々のsgRNAをクローン化する必要がなく、時間と労力を節約できます。

Cas9ヌクレアーゼ発現プラスミドを用いた実験データ

SMARTCas9-mKate2発現プラスミドを使用したCas9発現U2OS細胞のFACSによる濃縮は、標的ゲノム編集の増加をもたらす

FACSによるSMARTCas9-mKate2発現プラスミドを使用したCas9発現U2OS細胞の濃縮により、ヒトPPIBの編集%が増加します。U2OS細胞に、SMARTCas9-mKate2（ヒトCMVプロモーターを含む）発現プラスミド、およびヒトPPIB遺伝子を標的とするtracrRNA:crRNAをトランスフェクトしました。72時間後にMoFlo XDP 100機器でmKate2蛍光のnegative、low、high対応する細胞をソーティングし、3つのチューブに分けました。SURVEYOR™ DNAミスマッチアッセイは、選別されたU2OS細胞で実行し、%ゲノム編集が、US（= unsorted）および対照であるUT（= untransfected）と比較しました。編集のレベルは、デンシトメトリー（%編集）を使用して計算しました。ソーティング細胞では、mKate2発現の増加と相関して、%ゲノム編集の増加が観察されます。

Cas9-mKate2発現プラスミドのベクターエレメントとプロモーターオプション

Cas9-mKate2 プラスミドは、単量体赤色蛍光タンパク質mKate2、および6種類のRNA pol II プロモーターのいずれかによって駆動されるS. pyogenes由来のヒトコドン最適化Cas9ヌクレアーゼを発現します。自己切断ペプチドT2Aを使用してmKate2の発現をCas9ヌクレアーゼにリンクすることにより、FACSによるmKate2陽性細胞のソーティングによりCas9発現細胞が濃縮され、ゲノム編集イベントを受けた細胞のパーセンテージが増加します。

Cas9-PuroR発現プラスミドのベクターエレメントとプロモーターオプション

Cas9-PuroRプラスミドは、ピューロマイシン耐性選択マーカー、および6種類のRNA pol II プロモーターのいずれかによって駆動されるS. pyogenes由来のヒトコドン最適化Cas9ヌクレアーゼを発現します。自己切断ペプチドT2Aを使用してピューロマイシン耐性マーカーの発現をCas9ヌクレアーゼにリンクすることにより、ピューロマイシンで処理して細胞を選択すると、Cas9発現細胞が濃縮され、ゲノム編集イベントを受けた細胞のパーセンテージが増加します。

1. D. Bhaya, M. Davison, et al. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annu. Rev. Genet. 45, 273-297 (2011).
2. L. Cong, F. A. Ran, et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339(6121), 819-823 (2013).
3. E. Deltcheva, K. Chylinski, et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471(7340), 602-607 (2011).
4. Y. Fu, J. D. Sander, et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat. Biotechnol. (2014).
5. D.Y. Guschin, A. J. Waite, et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).
6. F. Heigwer, G. Kerr, et al. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat. Methods. 11(2), 122-123 (2014).
7. P.D. Hsu, D. A. Scott, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31(9), 827-832 (2013).
8. M. Jinek, K. Chylinski, et al. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. 337(6096), 816-821 (2012).
9. P. Mali, L. Yang, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339(6121), 823-826 (2013).
10. N. K. Pyzocha, F. A. Ran, et al. RNA-Guided Genome Editing of Mammalian Cells. Methods Mol. Biol. 1114, 269-277 (2014).
11. D. Reyon, C. Khayter, et al. Engineering designer transcription activator-like effector nucleases (TALENs) by REAL or REALFast assembly. Curr. Protoc. Mol. Biol. 100, 12.15.1 12.15.14 (2012).
12. T. R. Sampson, D. S. Weiss. Exploiting CRISPR/Cas systems for biotechnology. Bioessays. 36(1), 34-38 (2014).
13. T. Wang, J. J. Wei, et al. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343(6166), 80-84 (2014).