Pin-point™化学合成 sgRNA non-targetingコントロール

ゲノム編集
Pin-point™ 塩基編集プラットフォーム
Pin-point™ 試薬
Pin-point™化学合成 sgRNA Non-targetingコントロール

Pin-point™化学合成 sgRNA non-targetingコントロール

Pin-point塩基編集を評価するためのnon-targeting化学合成コントロール。バイオインフォマティクスに基づき、ヒトゲノムのどの遺伝子も標的としないように設計されています。

Pin-point™化学合成 sgRNA non-targetingコントロールは、Pin-point 塩基編集実験のネガティブコントロールとして使用するよう設計および推奨されています。これらのnon-targetingコントロールは Pin-point 塩基編集複合体と作用しますが、ヒトゲノムの PAM 隣接部位を標的とすることはありません。これらのコントロールで処理した細胞の生存率や遺伝子発現レベルの変化は、標的特異的Pin-point化学合成sgRNAで処理した細胞のレベルと比較できるベースラインの細胞応答を反映していると考えられます。

Highlights

独自のアラインメントツールにより、ヒトゲノムのあらゆる潜在的標的とのミスマッチやギャップを検証済み
ベースラインレベルの確立に最適

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Pin-pointプラットフォームによる塩基編集は、DNAの二本鎖切断やインデル（indel）を形成することなく、特異的なヌクレオチド変化を誘導します。

このシステムは3つのコンポーネントから構成されています：

[1] DNAの一本鎖のみを切断または「ニッキング」するウラシルグリコシラーゼ（UGI）阻害剤と融合したヌクレアーゼ欠損「ニッカーゼ」nCas9（Komor, 2016）
[2] アプタマー結合タンパク質と融合したシチジンデアミナーゼ塩基編集酵素（Rat APOBEC）。シチジンデアミナーゼ酵素は、塩基対が編集ウィンドウ（プロトスペーサーのPAM遠位端の4から8位）内にある場合、C-G塩基対をT-A塩基対に変換します（Collantes, 2021）。
[3] nCas9とアプタマー：デアミナーゼ融合体を特定のDNA標的部位に誘導するアプタマー性シングルガイドRNA（sgRNA）。

哺乳類細胞に3つの構成要素すべてを導入することで、標的部位のC-GからT-Aへの塩基変換が誘導されます。このシステムは、遺伝子ノックアウト（未成熟終止コドンの導入（Billon, 2017）、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位の破壊（Webber, 2019））、または点突然変異の導入に使用できます。

Illustration of Pin-point base editing system

Pin-point塩基編集システムの概要図
nCas9（薄い灰色）を利用することで、DNAの二本鎖切断が起こらず、DNA損傷応答経路がトリガーされません。Pin-point sgRNAにはアプタマー（緑）が含まれており、アプタマー結合タンパク質（オレンジ）を介してデアミナーゼ（青）をリクルートし、塩基編集を行います。

Table 1　Pin-point mRNA必要量

* Note：最適な結果を得るためには、各試薬の正確な量を、実験セットアップ、細胞タイプ、細胞数、プレートフォーマットごとに最適化する必要があります。
	ウェル／フォーマットサイズごとの反応数*
	HEK 293T細胞（96ウェルプレートで50,000細胞／ウェル）		T細胞（24ウェルプレートで250,000細胞／ウェル）
	Pin-point nCas9 mRNA	Pin-point Rat APOBEC mRNA	Pin-point nCas9 mRNA	Pin-point Rat APOBEC mRNA
	1 µg/well	0.1 µg/well	1.56 µg/well	0.22 µg/well
20 µg	20	200	12	90
100 µg	100	1000	64	450
500 µg	500	5000	320	2252

Table 2　Pin-point sgRNA必要量

* Note：最適な結果を得るためには、各試薬の正確な量を、実験セットアップ、細胞タイプ、細胞数、プレートフォーマットごとに最適化する必要があります。
	ウェル／フォーマットサイズごとの反応数*
	HEK 293T細胞（96ウェルプレートで50,000細胞／ウェル）	T細胞（24ウェルプレートで250,000細胞／ウェル）
	60 pmol/well	Singleplex 20 pmol/well or Multiplex (3 guides) at 20 pmol/well each
2 nmol	33	100
5 nmol	83	250
10 nmol	166	500

Fig 1

初代ヒトT細胞におけるマルチプレックス塩基編集
Pin-point塩基編集プラットフォームは、多くの実験やT細胞ドナーにおいて効率的で再現性が良好です。活性化T細胞に、Pin-point mRNAと3つの標的（CD52、PDCD1、TRAC）に対するPin-point化学合成sgRNA、またはnon-targetingコントロール（NTC #1）sgRNAをエレクトロポレーションしました。Mockエレクトロポレーション（EP）細胞をネガティブコントロールとして使用しました。エレクトロポレーション後6～7日目に細胞を回収し、Pin-point解析用プライマーを用いてPCR産物のサンガー配列決定データから塩基編集レベルを算出しました。
T細胞ドナー（N = 8）、5つの独立した実験、二重または三重のテクニカルレプリケート。ヒゲは平均値 ± SD

Pin-point reagents supporting data Figure 2A

初代ヒトT細胞におけるマルチプレックス塩基編集の表現型解析
Pin-point塩基編集プラットフォームは、初代T細胞を効率的に多重遺伝子ノックアウトします。活性化T細胞に、3つの標的（CD52、PDCD1、TRAC）に対するPin-point mRNAおよびPin-point化学合成sgRNAをエレクトロポレーションし、7日後にフローサイトメトリーで解析しました。PD1の発現を誘導するために、T細胞は48時間前にPMA（phorbol 12- myristate 13-acetate）とイオノマイシンの存在下で培養しました。CD52とTCRa/bの発現は非刺激細胞を用いて分析しました。図は、編集サンプルおよびモックエレクトロポレーション（EP）サンプルの、生細胞における各マーカー陰性細胞の割合示しています。
T細胞ドナー（N = 2）の二重または三重のテクニカルレプリケート。ヒゲは平均値 ± SD

Pin-point reagents supporting data Figure 2B

初代ヒトT細胞におけるマルチプレックス塩基編集のフローサイトメトリープロット
編集サンプルとコントロールサンプルの、3つの各マーカーの代表的フローサイトメトリープロット。各マーカーの陰性細胞のゲーティングは生細胞で行われています。

Pin-point reagents supporting data Figure 2C

塩基編集によるトリプルノックアウトの編集効率
サンプル中の3つのマーカー（CD52、PD1、TCRa/b）が同時に陰性である細胞の割合。Pin-pointプラットフォームで編集したサンプル、およびモックエレクトロポレーション（EP）コントロールで、追加濃縮を行わず、生細胞における割合として示されています。PD1の発現を誘導するため、3つのマーカーを同時に定量できるように、分析前にT細胞をPMA（phorbol 12- myristate 13-acetate）とイオノマイシンの存在下で48時間培養しました。
T細胞ドナー（N = 2）、二重または三重のテクニカルレプリケート。ヒゲは平均値 ± SD

Pin-point reagents supporting data fig 2D

トリプルノックアウト塩基編集のフローサイトメトリーゲーティング戦略
編集サンプルの代表的フローサイトメトリープロットでゲーティング戦略を示しています。左より、生細胞でゲーティングされたCD52陰性集団、CD52陰性集団でゲーティングされたTCRa/b陰性集団、CD52とTCRa/b二重陰性集団でゲーティングされたPD1陰性集団。右端のゲートの細胞数は、3つのマーカーすべてが陰性細胞となります。トリプル陰性の細胞数は生細胞数で正規化し、上図にその割合を示しています。